第三章_非细胞型微生物3学时

第三章非细胞型微生物 研究历史 1892年俄国学者Ivanovsky首次发现烟草花叶病毒的感染因子能通过细菌过滤器 1898年荷兰的Beijerinck将病原体命名叫virus 1935年美国的Stanley首次提纯并结晶了TMV 随后英国的BawdenandPirie证实该结晶只含核酸和蛋白质两种成分 1952年HersheyandChase证实噬菌体的遗传物质是DNA 1971年Diener发现只含RNA一种成分的类病毒 1981年Randles等又发现了拟病毒 卫星病毒 1982年Prusiner发现了只含蛋白质一种成分的朊病毒 一 病毒基本特点 病毒颗粒非常微小 用电子显微镜才能观察到 病毒颗粒主要由核酸和蛋白质组成 每一种病毒只含一种核酸 或RNA或DNA 病毒不是以二分裂方式繁殖 只能在活的宿主细胞内复制新的子代病毒 除利福平可抑制痘病毒复制外 其他抗生素对病毒的作用都不大 干扰素可抑制多数病毒的复制 补充 病毒与其他微生物的区别要点 说明 D DNA 脱氧核糖核酸 R RNA 核糖核酸 有些细菌与立克次氏体对干扰素也敏感 二 病毒的分类 第一节病毒的形态构造 电镜下的病毒 一 大小及形态20 300nm砖形 弹形 球形 蝌蚪形 杆形等多形性 噬菌体形态 SASVirus 图例病毒的多形性 几种病毒的形态和大小 Thecomparativesizesofseveralvirusesandbacteria 球形 二十面体对称 如腺病毒 杆状 螺旋对称 如烟草花叶病毒 蝌蚪状 复合对称 如大肠杆菌噬菌体 病毒的形态 球形 二十面体对称 腺病毒 杆状 螺旋对称 烟草花叶病毒 蝌蚪状 复合对称 大肠杆菌偶数噬菌体 病毒的对称体制 二十面体立体对称的代表 腺病毒 刺突 顶球 螺旋对称的代表 烟草花叶病毒 TMV 复合对称的代表 T偶数噬菌体 头部颈部颈环颈须尾部尾鞘尾管基板刺突尾丝 E coli的T4噬菌体模式图 二 结构及化学组成 核酸 决定病毒遗传 变异和复制 蛋白质 支架结构和抗原成分 保护核酸 核心 衣壳 包膜 类脂 与病毒的宿主专一性和侵入等有关 1 核酸 Nucleicacid DNA或RNA 有单股和双股之分 失去衣壳的裸露核酸如具有传染性则称为感染性核酸 核酸蕴藏着病毒遗传信息 主导病毒的生命活动 形态发生 遗传变异和感染性 2 衣壳 Capsid 包围在核酸外的一层蛋白质 衣壳是由许多 壳微粒 按一定几何构型集结而成 壳微粒在电镜下可见 是病毒衣壳的形态学亚单位 它由一至数条结构多肽构成 图例 病毒核衣壳的构造模式图 病毒的辅助结构1 囊膜 Envelope 某些病毒 在核衣壳外包绕着一层含脂蛋白的外膜 称为 囊膜 如虫媒病毒 人类免疫缺陷病毒 疱疹病毒等 囊膜中含有双层脂质 多糖和蛋白质 其中蛋白质具有病毒特异性 常与多糖构成糖蛋白亚单位 嵌合在脂质层 表面呈棘状突起 称 剌突 Spike 有囊膜病毒对脂溶剂和其他有机溶剂敏感 失去囊膜后便丧失了感染性 2 触须样纤维 Fiber 腺病毒是唯一具有触须样纤维的病毒 腺病毒的触须样纤维是由线状聚合多肽和一球形末端蛋白所组成 位于衣壳的各个顶角 该纤维吸附到敏感细胞上 抑制宿主细胞蛋白质代谢 与致病作用有关 此外 还可凝集某些动物红细胞 3 病毒携带的酶某些病毒核心中带有催化病毒核酸合成的酶 如流感病毒带有RNA的RNA聚合酶 这些病毒在宿主细胞内要靠它们携带的酶合成感染性核酸 第二节病毒的增殖 特点 由于病毒缺少完整的酶系统 不具有合成自身成份的原料和能量 也没有核糖体 因此决定了它的专性寄生性 必须侵入易感的宿主细胞 依靠宿主细胞的酶系统 原料和能量复制病毒的核酸 借助宿主细胞的核糖体翻译病毒的蛋白质 病毒这种增殖的方式叫做 复制 Replication 从病毒感染细胞 进入细胞 到复制子代病毒后释放出来的全过程 称为复制周期 replicationcycle 或增殖周期 也叫感染周期 吸附 病毒的增殖过程 穿入 脱壳 早期蛋白 晚期蛋白 装配 DNA复制 核酸游离 成熟 释放 过程 吸附穿入脱壳生物合成装配释放 图例 各种病毒的复制过程 灰质炎v 粘v 腺v 疱疹v 多瘤v 图例 1 吸附 吸附 图例 2 穿入 侵入 图例 3 脱壳 图例 4 5 合成 装配 释放 不同核酸型的病毒在感染宿主后的mRNA合成方式 装配 释放 噬菌体的繁殖过程 第三节病毒的干扰现象 一 干扰现象当二种病毒感染同一细胞时 一种病毒可以增殖 而另一种病毒则被抑制 这种现象称为干扰现象 Interference 产生干扰现象的可能原因 1 占据或破坏细胞的病毒受体2 争夺酶和原料3 诱导产生了干扰素 二 干扰素机体细胞受到病毒 或其他微生物 感染后所产生的一种低分子蛋白质 被其他的细胞吸收后能抑制多种病毒的感染 这种物质称为干扰素 按产生细胞及性质不同 干扰素分为3型 IFN IFN IFN 干扰素制剂已用于治疗一些病毒感染 如慢性乙型肝炎 单纯疱疹病毒毒性角膜炎 带状疱疹及呼吸道病毒感染 和恶性肿瘤 如成骨肉瘤等 第四节病毒的抵抗力与变异 一 病毒对理化因素的抵抗力 一 物理因素1 温度 大多数病毒 除肝炎病毒外 耐冷而不耐热通常在 20 196 仍不失去活性 但对反复冻融则敏感 2 盐类 对病毒有稳定作用 克分子浓度的盐可提高病毒对热的抵抗力 3 pH 病毒一般在pH5 0 9 0的环境是稳定的4 射线 紫外线 X线和高能量粒子可杀活病毒 二 化学因素1 脂溶剂有囊膜病毒可迅速被脂溶剂破坏 如乙醚 氯彷 去氧胆酸钠 病毒对脂溶剂的敏感性可作为病毒分类依据 2 甘油大多数病毒在50 甘油盐水中能活存较久 因病毒体中含游离水 不受甘油脱水作用的影响 故可用于保存病毒感染的组织 3 化学消毒剂一般都很敏感 4 抗生素抗生素及磺胺对病毒无效 病毒的抵抗力 耐冷怕热紫外线敏感氧化剂敏感包膜病毒对脂溶剂敏感耐甘油 二 病毒的变异 一 突变1 毒力改变 有强毒株及弱毒株 2 条件致死突变株 其中最主要是的是温度敏感条件致死突变株 简称温度敏感突变株 在特定温 28 35 下孵育则能增殖 在非特定温度 37 40 下孵育则不能繁殖 可用于制备减毒活疫苗 3 宿主适应性突变株 例如狂犬病毒突变株适应在兔脑内增殖 由 街毒 变为 固定毒 可制成狂犬病疫苗 二 基因重组1 活病毒间的重组流感每隔十年左右引起一次世界性大流行 可能是由于人的流感病毒与某些动物 鸡 马 猪 的流感病毒间发生基因重组所致 2 灭活病毒间的重组3 致弱病毒间的重组 三 基因产物的相互作用1 表型混合 Phenotypemixing 2 基因型混合 Genotypemixing 3 互补 Complementation 4 增强 Enhancement 四 病毒变异的实际意义1 研制减毒活疫苗如ts株 宿主适应性突变株的研制 2 应用于基因工程 Geneticengineering 目前病毒基因工程正沿着二个方向发展 一是将编码病毒表面抗原的基因移植到质粒中去 在大肠杆菌中产生大量表面抗原物质 以制备疫苗或诊断用抗原 如乙型肺炎病毒编码表面抗原的DNA片段已在酵母菌中表达 该疫苗正进行人体观察 二是探索病毒作为基因工程载体的可能性 以便将所需要的外源基因带入人体或支物体内 以治疗人类遗传疾病或创造动物新品种的目的 第五节病毒的培养 一实验动物培养法要求被接种动物健康无病且无相应抗体 作用 1 病原体检查 2 传染病的诊断 3 抗血清的生产及高免蛋白液的制备 按病毒侵袭部位不同选择适当的接种途径 嗜神经病毒接种在小鼠的脑内 痘苗病毒和单纯疱疹病毒接种于家兔角膜 SPF动物 SpeceficpathogenFree SPF 无特定病原体动物 指不携带潜在感染或条件致病菌 但带有非特定的微生物和寄生虫的动物 SPF动物的种群来源于无菌动物或剖腹产净化动物 常见SPF动物包括小鼠 大鼠 豚鼠 地鼠 兔 犬和猴等 二鸡胚培养可分别接种在鸡胚绒毛尿囊膜 尿囊腔 羊膜腔 卵黄囊 脑内或静脉内 图例 鸡胚接种示意图 可能的病变 1 胚胎死亡胚胎不动 血管网消退 不再生长2 胚胎出血或畸形3 绒毛尿囊膜出现斑点斑块作用 1 生产疫苗2 传染病的诊断 三细胞培养是指利用机械 酶或化学方法使动物组织或传代细胞分散成单个乃至2 4个细胞团悬液进行培养 优点 不受机体免疫力的影响 便于接种 观察病变 收集病毒 根据细胞来源 染色体特征及传代次数 可分为三种类型 原代细胞 动物组织经胰蛋白酶消化处理 使细胞分散而得到的细胞 二倍体细胞 将长成单层的原代细胞消化分散成单个细胞 继续培养传代 其染色体数与原代细胞一样 保持其二倍染色体数目的细胞 称为二倍体细胞 传代细胞 能在体外持续增殖传代的细胞 大多数由癌细胞或二倍体细胞突变而成 一 细胞的类型 二 细胞培养的方法 静置培养 实验室常用 细胞悬液装瓶 5 CO2温箱静置培养 细胞沉降并贴附在玻面上生长分裂 最后长成单层 旋转培养 大规模生产疫苗 细胞在玻瓶内生长时 玻瓶不断缓慢旋转 细胞贴附于玻瓶四周 长成单层 第六节病毒与细胞的相互作用 杀细胞感染非杀细胞感染引致持续感染 对细胞代谢无影响 产生干扰素 由病毒感染导致的细胞损伤 CPE能在光学显微镜下观察 细胞圆缩 如痘病毒和呼肠孤病毒等 细胞聚合 如腺病毒 细胞融合形成合胞体 如副粘病毒和疱疹病毒 有些病毒能形成包涵体 病毒引致的杀细胞变化 一 细胞病变效应 cytopathiceffect CPE 正常细胞 CPE CPE观察 正常单层A72细胞 接种CCV后出现细胞拉网的单层A72细胞 CPE观察 CPE观察 正常单层A72细胞 接种犬冠状病毒 CCV 后形成合胞体的的单层A72细胞 合胞体 syncytia 是病毒感染后导致感染细胞及相邻细胞细胞膜融合的产物 表现为若干细胞的相邻细胞膜消失 成为多核巨细胞 能够使半数组织细胞在一定条件下发生细胞病变的病毒量 用于判定病毒的毒力 50 组织细胞感染量 TCID50 二 空斑试验 将适当浓度的病毒悬液加入单层细胞培养中 当病毒吸附细胞后 再覆盖一层融化的琼脂 病毒在细胞内复制后产生局限性病灶 病灶逐渐扩大 肉眼也能看见 此即空斑试验 空斑是由一个感染性病毒粒子复制形成的 类似于细菌的菌落 称为空斑形成单位 PFU 病毒悬液中的感染性病毒量以每毫升含有的PFU来表示 CELLS phage avirusthatisparasiticinbacteria itusesthebacterium smachineryandenergytoproducemorephageuntilthebacteriumisdestroyedandphageisreleasedtoinvadesurroundingbacteria 空斑试验的用途 1 测定病毒数量2 纯化病毒单个空斑作悬液 梯度稀释后再作空斑 可获得病毒克隆 3 鉴定病毒不同病毒的空斑具有不同的特征 三 包涵体 inclusionbody 定义 是某些病毒感染细胞产生的特征性的形态变化 在普通光学显微镜下可见胞浆或胞核内出现的呈嗜酸性或嗜碱性染色 大小数量不等的圆形或不规则形的团块状结构 称为包涵体 包涵体的性质 病毒成分的蓄积 如狂犬病毒的Negri氏体大量晶格样排列的病毒颗粒组成 如腺病毒的包涵体细胞变性的产物 不含病毒 如疱疹病毒的包涵体 狂犬病毒包涵体 Negribody 第七节亚病毒 subvirus 亚病毒 subviruses 是一类比病毒更为简单 仅具有某种核酸不具有蛋白质 或仅具有蛋白质而不具有核酸 能够侵染动植物的微小病原体 它包括类病毒 拟病毒 朊病毒 一 类病毒 Viroids 类病毒是一类能感染某些植物致病的单链闭合环状的RNA分子 类病毒基因组小 分子量为1 105 1971年Diener首次报道 引起马铃薯纺锤形块茎病 PSTD 的病原体只含RNA一种成分 PSTV的结构模型 二 拟病毒 卫星因子 必须依赖宿主细胞内共同感染的辅助性病毒才能复制的核酸分子 有的拟病毒也有外壳蛋白包裹 这些又称卫星病毒 Satelliteviruses 1981年Randles等首次在绒毛烟的班驳病毒中分离得到 是二十面体病毒 在病毒的蛋白质衣壳内含有3种RNA分子 RNA 1 RNA 2 RNA 3 RNA 2和RNA 3单独存在时不具有侵染性 只有当RNA 1与其合在一起时才能感染宿主 具有此特性的称其为拟病毒 拟病毒 Virusoid 1982年 美国的Prusiner发现引起羊搔痒病的病原是一种蛋白质 PrP 称该病原为prion 由此荣获1997年诺贝尔生理和医学奖 可引起与哺乳动物脑部相关的疾病 如 人