《仪器分析》学生实验课件：NBS-荧光素-CTAC化学发光体系测定尿素的含量

仪器分析 学生实验课件NBS 荧光素 CTAC化学发光体系测定尿素的含量 化学化工学院环境科学教研室方卢秋2010年秋期 目录 一 概述二 实验的目的意义和要求三 实验原理1 实验装置示意图2 化学发光原理四 仪器药品1 主要仪器2 主要药品及储备液配制五 实验内容及操作步骤1 实验的主要内容2 实验操作步骤六 数据处理七 思考题 一 概述 1 化学发光及化学发光分析化学发光 Chemiluminescence 又称为冷光 ColdLight 是在没有任何光 热或电场等激发的情况下 由化学反应而产生的光辐射 生命系统中的化学发光 称为生物发光 Bioluminescence 它不依赖于有机体对光的吸收 而是一种特殊类型的化学发光 化学发光分析 ChemiluminescenceAnalysis 就是利用化学反应所产生的发光现象进行分析的方法 是近30多年来发展起来的一种新型 高灵敏度的痕量分析方法 在痕量分析 环境科学 生命科学及临床医学 食品安全等领域得到愈来愈广泛的应用 生物化学发光图 2 化学发光分析的基本原理化学发光是吸收化学反应过程产生的化学能 使反应产物分子或者其它物质分子被激发而发射的光辐射 任何一个化学发光反应都应包括化学激发和发光两个步骤 必须满足如下条件 1 化学反应必须提供足够的激发能 激发能主要来源于反应焓 2 要有有利的化学反应历程 使化学反应的能量至少能被一种物质所接受并生成激发态 3 激发态能释放光子或能够转移它的能量给另一个分子 而使该分子激发 然后以辐射光子的形式回到基态 化学发光反应效率 cl 又称化学发光的总量子产率 决定于生成激发态产物分子的化学激发效率 ce和激发态分子的发射效率 em 定义为 cl 发射光子的分子数 参加反应的分子数 ce em 3 化学发光反应的类型3 1直接化学发光和间接化学发光直接发光是被测物作为反应物直接参加化学发光反应 生成电子激发态产物分子 此初始激发态能辐射光子 A B C DC C h 式中A或B是被测物 通过反应生成电子激发态产物C 当C 跃迁回基态时 辐射光子 间接发光是被测物A或B 通过化学反应生成初始激发态产物C C 不直接发光 而是将其能量转移给F 使F跃迁回基态 产生发光 A B C DC F F EF F h 式中C 为能量给予体 而F为能量接受体3 2气相化学发光 液相和固相化学发光按反应体系的状态分类 如化学发光反应在气相中进行称为气相化学发光 在液相或固相中进行称为液相或固相化学发光 在两个不同相中进行则称为异相化学发光 1 气相化学发光主要有O3 NO S的化学发光反应 可用于监测空气中的O3 NO SO2 H2S CO NO2等 2 液相化学发光用于此类化学发光分析的发光物质有鲁米诺 光泽精等 3 3化学发光 生物化学发光和电致化学发光分析法根据供能反应的特点 可将化学发光分析法分为 1 普通化学发光分析法 供能反应为一般化学反应 简称CL 2 生物化学发光分析法 供能反应为生物化学反应 简称BCL 3 电致化学发光分析法 供能反应为电化学反应 简称ECL 等 3 4直接测定 偶合反应 时间分辩和酶免疫化学发光分析法根据测定方法的不同又可分为 1 直接测定CL分析法 2 偶合反应CL分析法 通过反应的偶合 测定体系中某一组份 3 时间分辨CL分析法 即利用多组份对同一化学发光反应影响的时间差实现多组份测定 4 酶免疫CL分析法等 4 化学发光的测量装置化学发光分析法的测量仪器主要包括样品室 光检测器 放大器和信号输出装置 化学发光反应在样品室中进行 样品和试剂混合的方式有不连续取样体系 加样是间歇的 将试剂先加到光电倍增管前面的反应池内 然后用进样器加入分析物 另一种方法是连续流动体系 反应试剂和分析物是定时在样品池中汇合反应 且在载流推动下向前移动 被检测的光信号只是整个发光动力学曲线的一部分 以峰高进行定量测量 按照进样方式 可将化学发光分析仪分为分离取样式和流动注射式两类 BPCL型微弱发光测量仪 IFFM D型流动注射化学发光分析仪 5 流动注射分析介绍 流动注射分析是70年代中期诞生并迅速发展起来的溶液自动在线处理及测定的现代分析技术 流动注射分析方法主要有 流动注射分光光度法 流动注射原子光谱法 流动注射电化学分析法 流动注射酶分析法 流动注射荧光及化学发光法 流动注射免疫分析法 流动注射在线分离浓集 在线消解等操作方法和技术 流动注射法具有以下优点 测量在动态条件下进行 反应条件和分析操作能自动保持一致 结果重现性好 耗样量少 分析速度快 特别适合于大批量样品分析 不仅易于实现连续自动分析 且可方便地用于比色 离子电极 原子吸收分析 6 流动注射化学发光分析仪简介 IFFM E型流动注射化学发光分析仪是国内最早推出的全自动化学发光检测分析系统 仪器集成了高精度双蠕动泵数控宽调速流动注射进样系统 多功能超微弱化学发光检测器及功能强大的化学发光检测与数据采集及化学分析动力学谱图分析软件 可进行静态注射化学发光分析 流动注射化学发光等分析 7 尿素及其分析方法 尿素 又称为脲 其作用与山梨醇基本相同 为渗透性利尿药 临床用于脑水肿 颅内压增高 青光眼 烧伤 创伤和术后的尿少症 外用可治疗某些皮肤病 尿液和血清尿素氮的测定 对急性肾功能衰竭 尤其是尿毒症的诊断有特殊价值 其增高程度与病情的严重性成正比 对判断病情和预后的估价有重要作用 建立快速 准确 灵敏的尿素测定方法 在药物分析 临床治疗 医学诊断等方面有重要的意义 测定尿素的方法主要有 生物传感器法 紫外 可见法 HPLC法等 在碱性条件下 荧光素作为能量转移剂 NBS氧化尿素产生化学发光 十六烷基三甲基氯化铵 CTAC 对该体系具有强烈的增敏作用 据此建立NBS 荧光素 CTAC流动注射化学发光体系测定尿素的分析方法 具有更宽的线性范围和更低的检出限 测定的线性范围为 3 10 5 7 10 8g mL 方法的相对标准偏差 RSD 为4 6 5 10 8g mL n 11 检出限 3 为3 0 10 9g mL 本法可用于人体尿液中尿素含量的测定 二 实验的目的意义和要求 1 巩固化学发光分析法理论知识 2 了解流动注射化学发光分析仪的结构 掌握仪器操作 化学发光实验原理 3 掌握化学发光实验条件优化的操作步骤 建立流动注射化学发光分析法 三 实验原理 1 实验装置示意图P1 P2 蠕动泵 V 八通阀 F 流通池 PMT 光电倍增管 HV 负高压 PC 计算机控制的化学发光分析仪 A 样品 B NBS C 荧光素 NaOH CTAC溶液 2 化学发光原理碱性条件下 NBS的氧化性来自其水解产物HBrO 其氧化特性类似于HBrO 但较HBrO稳定 尿素分子中含有还原性的胺基 NH2 可被HBrO氧化 产生的化学能激发共存的荧光素 从而产生化学发光 可能的反应机理如下 NBS H2O NHS HBrO即尿素 HBrO OH 产物 产物 荧光素 荧光素 产物荧光素 荧光素 h 四 仪器药品 1 主要仪器IFFM D型流动注射化学发光分析仪 西安瑞迈电子科技有限公司生产 离心机 0 4000r min 常州国华电器有限公司生产 电子分析天平 EL104 梅特勒 托利多 上海 有限公司 2 主要药品及储备液配制 五 实验内容及操作步骤 1 实验的主要内容1 1样品稀释的酸碱性选择实验盐酸 硫酸 氢氧化钠 碳酸氢钠 水稀释作对照 浓度为0 05mol L 1 2荧光物质种类的选择实验罗丹明 6G 荧光素钠 荧光素 二氯荧光素 水稀释作对照 浓度为8 10 5mol L 1 3荧光物质浓度的选择实验荧光素浓度在1 10 6 8 10 4mol L范围内选择 1 4反应介质的种类选择实验氢氧化钠 氢氧化钾 碳酸氢钠 水稀释作对照 浓度为0 05mol L 1 5反应介质的浓度选择实验考察荧光素中氢氧化钠在0 03 0 50mol L浓度范围内对化学发光信号强度的影响 1 6表面活性剂的种类选择实验十二烷基苯磺酸钠 SDBS 吐温80 十六烷基三甲基溴化铵 CTAB 十六烷基三甲基氯化铵 CTAC 水稀释作对照 浓度为3 10 3mol L 1 7表面活性剂的浓度选择实验考察CTAC物质的量浓度在5 10 4 7 10 3mol L范围内对化学发光信号强度的影响 1 8NBS浓度的选择实验实验考察NBS物质的量浓度在0 008 0 03mol L浓度范围内对化学发光体系的影响 2 实验操作步骤2 1化学发光仪的使用A 连接好蠕动泵 化学发光仪主机 分离式检测器 计算机主机及打印机电源线 信号线和聚四氟乙烯管路系统 仔细检查管线连接无误 B 打开总电源开关 启动化学发光仪主机电源 打印机电源 蠕动泵电源 再按下计算机电源启动电脑 点击IFFM分析系统 启动分析应用软化程序 进入主界面 C 编辑或者打开参数文件 D 所配制的各种溶液插入聚四氟乙烯管 E 点击启动测量按钮 仪器开始测量过程 根据需要调整测量时间 主副泵转速 根据信号大小调整负高压及增益 F 测量完毕 用蒸馏水洗涤各流路 洗涤时间不少于5分钟 抽干5分钟 松开蠕动泵 G 保存用户文件 关闭应用程序 运行计算机系统退出程序 关闭各仪器电源 最后关闭总电源开关 2 2样品处理取健康人体的新鲜尿液50mL 用移液管移取10 0mL 以35