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实验八蔗糖酶Km值测定 酶的动力学性质分析 是酶学研究的重要方面 Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度 不同的酶Km值不同 同一种酶与不同底物反应Km值也不同 Km值可近似的反应酶与底物的亲和力大小 Km值大 表明亲和力小 Km值小 表明亲合力大 测定Km和Vmax 特别是测定Km 是酶学研究的基本内容之一 底物浓度对酶活性的影响 原理 原理 米氏方程和双倒数作图法 酶反应速度与底物浓度之间的定量关系 S 表示底物浓度Vmax表示最大酶促反应速度 Lineeraver Burk 林 贝氏作图法 实验步骤 一 蔗糖酶溶解二 蔗糖酶稀释以及活力测定三 底物对反应速度的影响 Km测定 一 蔗糖酶的溶解 酶粉溶于1ml蒸馏水 10000rpm室温离心5分钟后去掉不溶物 此时即为酶原液 二 蔗糖酶稀释以及活力测定 1 将酶原液按照一定比例稀释 建议1 10 1 20 1 50和1 100 不同稀释倍数的酶液各准备2ml 2 稀释后酶液的活力测定 为什么要将酶液进行稀释 为什么选择合适酶活力的酶液进行Km测定 3 葡萄糖标准曲线的制备 酶活力预试 取出后经自来水冷却3min 加入9ml蒸馏水 以对照管调零点 于520nm处测光密度值 要求测得的A520nm值在标准曲线范围内靠近最大值 为什么 葡萄糖标准曲线的制备 加毕混匀 盖上试管帽 于沸水浴 100 中准确煮5min 取出用自来水冷却3min 加入9ml蒸馏水 混匀后以零号管调零 于520nm处测定光密度 以葡萄糖含量为横坐标 以光密度为纵坐标画葡萄糖标准曲线图 底物浓度与酶促反应速度 每只试管均要做自身对照 结果处理 v代表生成产物葡萄糖的速率 5min单位时间内1ml酶液反应生成的葡萄糖的 S 0 3V 2 S 代表底物蔗糖的摩尔浓度 V代表每只试管中加入的底物蔗糖的体积 ml 2指
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