动物细胞克隆研究进展

动物细胞克隆研究的进展 生物科学与工程学院 10级生物技术 1 班 郭柳 刘云森 张孟星 克隆的定义 克隆 clone 是指通过无性生殖而产生的遗传上均一的生物群 即具有完全相同的遗传组成的一群细胞或者生物的个体 克隆在希腊语中是 小树枝叶 的意思 用以指无性增殖物 现在则指个体 细胞 基因等不同水平上的无性增殖物 哺乳动物体细胞克隆技术主要包括五个步骤 1 供体核的准备 2 受体细胞质的选取 3 核质重组融合 激活技术 4 重组胚的体内或体外培养 5 重组胚胎的移植 1供体核的准备 实验证明 在哺乳动物体细胞克隆中 并非一切体细胞都可作为供核细胞进行核移植 胎儿成纤维细胞因在克隆前能进行基因修饰 故目前大多数家畜的克隆都以它为供核细胞 另外 输卵管及子宫上皮细胞 卵丘细胞 颗粒细胞 耳细胞等也可作为供核细胞 2受体细胞质的选取 研究人员早期曾以受精卵或去核2 细胞胚作为受体卵 后期实验证明 成熟卵母细胞比受精卵或2 细胞胚更适合于用作核移植的受体细胞质 它能使各个发育时期胚胎甚至体细胞核重新编程 近年来通常以第二次减数分裂中期卵母细胞取代原核受体 解决核受体问题 3核质重组融合 激活技术 研究人员早期主要以卵周隙注射法进行核质重组 由于在核质重组过程中微吸管容易损坏卵膜及一部分细胞质 成功率偏低 需对重组胚融合 融合法有 早前采用的仙台病毒法激活核质 随后采用的电融合法 和近年来 人们普遍采用商业公司销售的激活剂法 4重组胚的体内或体外培养 重组胚胎激活后 有体内和体外两种培养方式 体内培养是将激活的重组胚胎植入同种或异种动物输卵管中 经数天后检测发育正常的囊胚 然后进行胚胎移植 体外培养是将激活后的重组胚在培养液中培养至囊胚 再挑选优质的胚胎移入到同步发情的同种雌性动物输卵管中 5重组胚胎的移植 在早期的研究中 为了提高胚胎的发育成功率 Campbell等采取了体内培养技术 后来研究发现 该方法不仅成本高 而且并无多大的优越性 Wells等人经过技术改良 发现体外培养的核移植胚胎的囊胚率可达到正常的体外受精胚胎的水平 目前 重组胚移植到经同期化处理的受体母畜中的程序 与常规胚胎移植相同 影响细胞克隆成功的因素 1体细胞核是否重新编程2体细胞的选择3受体卵母细胞的选择4去核方法5活化方法 1 体细胞是否重新编程 能否成功的进行重编程决定了克隆的成功与否 核移植中重编程的重要过程 是将已分化的体细胞的DNA进行甲基化扭转 并重新建立 使其恢复为合子时的状态 即表达胚胎发生过程中的基因 2 体细胞的选择 2 1体细胞的细胞周期不同细胞周期的细胞其DNA含量不同 核移植后将决定重构胚的倍性 2 2体细胞的类型 目前已诞生的多种克隆动物来自不同类型的细胞 包括纤维细胞 皮肤细胞 输卵管上皮细胞等 其克隆效率存在差异 这可能由于不同类型的细胞重编程的难易程度不同 3 受体卵母细胞的选择 供体细胞经核移植导入卵母细胞以后 紧接着发生核质相互作用 核中的众多因子被来自卵母细胞的因子所取代 因此 卵母细胞的选择成为影响核移植效率的重要因素 其因素包括 3 1卵母细胞所处的时期3 2卵母细胞的活化情况3 3卵母细胞的来源 4 去核方法 快速而准确的去核会避免孤雌发育 目前有三种去核方法 4 1盲去法4 2Hoechst3324显示法4 3蔗糖显示法 4 1盲去法 盲去法是较常用的去核方法 在刚排出的极体M2期卵母细胞上操作 用针将纺锤体和极体一起吸走 此方法简单易行 但去核时不彻底会造成孤雌生殖 4 2Hoechst3324显示法 Hoechst3324是一种DNA的活性染料 卵母细胞经其染色后 在紫外光激发下可清楚显示纺锥体 从而准确去核 此方法的缺点是紫外光照射会对卵母细胞造成一定的损伤 进而影响实验结果 4 3蔗糖显示法 将卵母细胞置于含蔗糖的操作液中 调节蔗糖浓度 卵母细胞的纺锤体会形成透明突起 然后可进行去核操作 这种方法去核率达95 且吸取的胞质很少 5活化方法 目前对活化方法的选择主要集中在活化时间和活化剂上 5 1活化时间 融合后的活化时间主要有两种 即时活化和延迟活化 现在普遍认为延迟活化有利于核的重编程 5 2活化剂 目前选用的活化剂主要有离子霉素 放线菌酮 6 DMAP等 不同的活化剂的组合有不同的发育率 活化剂的选择和活化方法上有不同的组合 随物种的种类而定 6重构胚的培养条件 目前倾向于认为培养液中的血清和共培养影响了重构胚的发育 实验发现含血清 共培养的胚胎后代出生时体重明显高于不含血清 非共培养的胚胎后代 且容易引起难产 另外 克隆胚胎与正常胚胎在培养条件的要求上有差异 使得克隆胚胎在生理和代谢上发生了一定的改变 这也可能是克隆胚胎发育率低的一个原因 7 种的差异 各种克隆动物的出生率虽然都不超过3 但其难易程度有所不同 例如 牛和鼠克隆后代的异常现象并未在克隆猪上出现 日本黑牛风出生率高达19 这些都说明 物种间生理条件的不同也是影响克隆效率的因素 动物细胞克隆成果展示 1996年 一只名叫多利的绵羊被成功克隆诞生 这只雌性绵羊一直存活了6年 这是世界上第一只被克隆的哺乳动物 它被认为是人类克隆研究领域上最大的成功 之后数以百计的类似多利的哺乳动物被克隆出来 多莉绵羊 山羊米拉是在1998年克隆的 当时它和自己的姐妹们是从美国实验室被制造出来 科学家利用家畜克隆技术生产对人体有益的药物成份 山羊米拉 这两头母牛是在1998年被成功克隆的 随后克隆了数千头母牛 这是日本克隆技术上的最大成果 这项技术也为其他克隆技术生产出更好的肉质和牛奶做出巨大贡献 母牛诺托和卡加 美国实验室引入基因改良猪 使这些克隆猪能够生长出适合人类的器官和细胞组织 此次一共克隆了5头雌性猪 其中最大的一头叫做米莉 它们是2000年美国一家生物公司成功克隆的 克隆猪 2000年 实验室首次成功克隆了一只叫做特拉的猕猴 后来科学家们陆续克隆了多只猴子 可用于研究人员测试糖尿病等病症 猕猴特拉 2000年 科学家在美国夏威夷成功克隆一只老鼠 这只老鼠被命名为 库姆利纳 Cumulina 它一直存活了两年7个月 据悉 这在克隆研究领域是一项重大突破 老鼠库姆利纳 2000年 一只叫做奥姆布雷塔的欧洲盘羊被成功克隆 科学家这样做是为了营救目前世界上数目稀少的欧洲盘羊 避免它们从地球上灭绝消失 欧洲盘羊奥姆布雷塔 这只名叫科毕的猫于2001年成功克隆 从此开辟了宠物克隆市场 并最终形成了克隆宠物的国际性行业 克隆猫科毕 2001年 科学家成功克隆出兔子 如图所示 他们克隆的兔子是纯白色 之后科学家陆续克隆了30多只兔子 兔子 2001年 一只叫做诺亚的亚洲野牛被成功克隆 据悉 近年来亚洲野牛的数量锐减 诺亚由于痢疾只存活了两天 野牛诺亚 2002年 一只叫做拉夫尔的大老鼠终于成功地被克隆 据悉 它经过15次克隆才最终成功 虽然像拉夫尔这样的大老鼠最终可能用于实验室研究 但是大老鼠的克隆技术较难实现 并且大老鼠的克隆对于人类医学研究意义重大 老鼠拉夫尔 2003年 美国德克萨斯州农业机械大学成功克隆了一只白尾鹿 并取名为杜威 虽然它的家族成员存在于北美洲地区多次动物克隆实验 但科学家们仍不懈进行克隆鹿实验 其目的是用于研究鹿基因 并形成更好的鹿基因 克隆鹿杜威 虽然目前非洲野猫并未灭绝 但2003年美国科学家还是克隆出了非洲野猫 作为克隆其他更容易出现数量骤减的物种样本 非洲野猫迪特尤克斯 2003年 意大利一支研究小组克隆出一只叫做普罗梅亚的种马 他们希望通过克隆的方法能够制造出更多的意大利种马 但是这项尝试失败了 克隆马普罗梅蒂亚 骡子是不能生育的 除非采用克隆技术 2003年 美国爱达荷州研究小组成功地克隆了一只叫做格姆的骡子 据悉 它不仅是第一只被成功克隆的马科动物 而且它也是第一只被克隆的无法生育的动物 骡子格姆 2004年 美国依阿华大学首次成功克隆出雪貂利比和利丽 这对于研究呼吸管疾病非常有用 同时雪貂也是濒危灭绝的物种 雪貂利比和利丽 2005年 韩国科学家挑战了一项克隆技术 最终他们利用干细胞移植手术培育出世界上第一只克隆狗 并将这只克隆狗命名为史努比 据悉 科学家利用干细胞移植手术培育方法可用于研究人类疾病 克隆狗史努比 2005年 首尔国立大学宣布成功地克隆了两只灰狼 这是保护环境和野生动物的一种有效措施 克隆狼 克隆利和弊 利 1 克隆实验的实施促进了遗传学的发展 为 制造 能移植于人体的动物器官开辟了前景 2 克隆技术可用于检测胎儿的遗传缺陷 将受精卵克隆用于检测各种遗传疾病 克隆的胚胎与子宫中发育的胎儿遗传特征完全相同 3 克隆技术可用于治疗神经系统的损伤 成年人的神经组织没有再生能力 但干细胞可以修复神经系统损伤 4 在体外受精手术中 医生常常需要将多个受精卵植入子宫 从中筛选一个进入妊娠阶段 但许多女性只能提供一个卵子用于受精 通过克隆可以很好地解决这一问题 弊 1 克隆将减少遗传变异 通过克隆产生的个体具有同样的遗传基因 同样的疾病敏感性 一种疾病就可以毁灭整个由克隆产生的群体 2 克隆技术的使用将使人们倾向于大量繁殖现有种群中最有利用价值的个体 而不是按自然规律促进整个种群的优胜劣汰 从这个意义上说 克隆技术干扰了自然进化过程 3 克隆技术是一种昂贵的技术 需要大量的金钱和生物专业人士的参与 失败率非常高 4 克隆技术应用于人体将导致对后代遗传性状的人工控制 克