多聚酶链式反应扩增DNA片段(优质课)

多聚酶链式反应 PCR技术 是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法 故又称为DNA体外扩增技术 课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段 1 DNA分子的组成成分和结构 DNA分子的基本组成单位是 共有种 每个基本单位是由一分子的 一分子的 和一分子的构成 脱氧核甘酸 4 磷酸 碱基 脱氧核糖 那么DNA分子的平面结构怎样呢 二 基础知识 A G C T 1 DNA的基本单位 脱氧核苷酸 多脱氧核苷酸链结构简图 一个核苷酸上的磷酸基团上的 OH 和另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基之间失去一分子水 形成磷酸二脂键 即在相邻的两个脱氧核苷酸的3 和5 碳原子之间形成磷酸二脂键 数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3 5 磷酸二脂键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链 通常将DNA的羟基 OH 末端称为3 端 而磷酸基团的末端称为5 端 4 多脱氧核苷酸链得形成 2 DNA分子的平面结构 5 端 3 端 识别 DNA分子的3 端与5 端 OH端为3 磷酸基团的末端为5 2 DNA分子复制的过程 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物 RNA 打开DNA双链 模板 合成子链原料 催化子链合成 使DNA聚合酶能从引物3 端开始连接脱氧核苷酸 思考 体内DNA复制的条件是什么 体外扩增DNA如何提供相似环境 变性 80 100 Taq聚合酶 耐高温 20 30个核苷酸构成DNA或RNA DNA双链 单链 变性 加热80 100 复性 缓慢冷却 4 DNA分子的热变性原理 变性的目的 复性的目的 解开双链 有利于引物 和引物 与两条单链的结合 一 PCR的原理 PCR的技术原理 时间 min 温度 适温延伸 高温变性 低温复性 重复1 3步30轮 3 DNA复制的方向 DNA的合成方向总是从子链的5 端向3 端延伸 2 步骤 变性 复性 延伸 PCR技术的原理总结 利用DNA分子的热变性原理 通过控制温度来控制双链的解旋与结合 从而完成体外DAN分子的扩增 体外DNA复制的条件 四种脱氧核苷酸 耐高温的DNA聚合酶 引物 模板 缓冲溶液 严格控制温度的温控设备 复制的方向 子链的5 端向3 端延伸 二 PCR的反应过程 变性95oC 5 引物1 5 引物2 5 5 模板DNA 25 30次循环 复制 后 模板DNA的含量可以扩大100万 220 倍以上 每个循环包括 变性 复性 延伸 从第二轮循环开始 上一次循环的产物也可以作为模板参与反应 并且由引物 延伸而成的DNA单链会与引物 结合 进行DNA的延伸 这样 DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列 使这段固定长度的序列呈指数扩增 PCR的反应过程总结 三 PCR反应的实验操作 1 PCR仪 设备及用具 2 微量离心管 一种薄壁塑料管 总容积为0 5ml 3 微量移液器 用于定量转移PCR配方中的液体 其上的一次性吸液枪头用一次更换一次 实质上一台能够自动调控温度的仪器 三 PCR反应的实验操作 1 按配方将所需试剂摆放在实验桌上 准备 2 用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分 移液 3 盖严离心管口的盖子 用手指轻轻弹击管壁 混合 4 将微量离心管放在离心机上 离心 5 将离心管放入PCR仪上 设置好PCR仪的循环程序 反应 四 结果分析与评价 DNA含量的测定 稀释 对照调零 测定 计算 公式见P63 波长260nm处读数 蒸馏水做对照 50倍 一 理论上DNA扩增数目的计算 四 课题成果评价 1 一条DNA 复制n次 DNA为2n 2 a条DNA 复制n次 DNA为ax2n 二 实验中DNA含量的测定 1 原理 可以通过测量DNA含量来评价扩增的效果 DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰 峰值的大小与DNA的含量有关 2 过程 稀释 2 LPCR反应液 加入98 L蒸馏水 即将样品进行50倍稀释 对照调零 以蒸馏水作为空白对照 在波长260nm处 将紫外分光光度计的读数调节至零 取DNA稀释液100 L至比色杯中 测定260nm处的光吸收值 测定并计算 DNA含量 g mL 50 260nm的读数 稀释倍数 50 在厚度为1cm比色杯中的吸光值为1 DNA的含量为50 g ml的 体内DNA复制与PCR的技术区别 课堂小结 练习巩固 1 关于PCR技术的应用 错误的一项是A古生物学 刑侦破案 DNA序列测定B诊断遗传疾病 基因克隆 古生物学CDNA序列测定 基因克隆 刑侦破案 D诊断遗传疾病 合成核苷酸 DNA序列测定 2 DNA的合成方向总是从子链的哪一端向哪一端延伸 3 PCR技术最突出的优点是A原理简单B原料易找CTaqDNA