端粒酶的知识

周俊宜中山医科大学生化教研室 与细胞衰老和癌变 zhoujy 中山医学院生化教研室 端粒 端粒酶 周俊宜 染色体DNA 端粒 端粒 人体的正常细胞经过有限的分裂次数后即进入衰老阶段 停止增殖而最终走向衰亡 呈恶性生长的癌细胞似乎摆脱了正常衰老过程的约束 在无拘无束地高速生长中获得 永生 衰老和肿瘤相互对立却又同为人类的 天敌 两者之间千丝万缕的关联一直以来为人们所关注 近年来端粒酶热点的出现被认为是联结着肿瘤和衰老研究的一条全新纽带 国际权威期刊单元 科学等逐年递增地刊载相关论文和报道 对端粒和端粒酶这一研究方向予以相当关注 认为有可能对肿瘤 衰老等重大生命课题产生深远影响 目录 端粒的结构与功能端粒酶的结构与功能端粒 端粒酶与细胞衰老端粒 端粒酶与恶性肿瘤 端粒的结构与功能 二十世纪三十年代 BarbavaMcClintock和HermannJ Muller发现 染色体的末端有一种能稳定染色体结构和功能的特殊成分 如果缺少了这种成分 染色体之间就会互相粘连 出现结构的变化或其它错误的行为 以致影响到染色体的生存和正确复制并进一步威胁到细胞的存亡 于是从希腊文的 末端 telos 和 部分 meros 二词为这种特殊的成分创造了一个全新的术语 端粒 telomere 1端粒的发现 断端降解 断端融合 结构功能破坏 染色体DNA X射线 从希腊字的末端 telos 和部分 meros 创造了一个全新的单词 端粒 telomere 端粒帽染色体端粒帽 端粒的精确组成则是在七十年代末才首次被提出 1978年 美国科学家Blackburn发现 单细胞池塘生物四膜虫 Tetrahymena 的端粒是由一种极短的简单重复序列TTGGGG多次重复而成 从那以后 包括动物 植物和微生物在内的多种生物的端粒序列已被确定 它们均是由富含G和T的简单重复序列不断重复而成 2端粒的精确组成 1978年首次发现四膜虫端粒的分子组成 端粒染色体DNA端粒 人端粒的分子组成 端粒帽染色体DNA端粒帽 n CCCCAA TTGGGG n n GGGGTT AACCCC n 3 5 3端粒结合蛋白 保护端粒不受核酸酶或化学修饰的作用一般是紧密的非共价键结合 随着对端粒分子组成结构的阐明 端粒对维护染色体完整性的功能已不是一个笼统的概念 活跃在细胞中枢并当担着延续生命重任的染色体脱氧核糖核酸其实面临的是一个 危机四伏 的境界 它对外要抵御核酸酶等各种因素袭击 对内则有一个难以 自圆其身 的所谓 末端复制问题 端粒的存在正是扮演了一个卫士的角色 它就象是一个尽忠职守的 生命卫士 不但避免了外界因素的入侵 而且在复制过程中 把基因组序列包裹在内部 以牺牲自身而避免染色体结构基因被侵蚀 从而防止了遗传信息的丢失 维护了染色体结构和功能的完整性 4端粒的功能 对外 抵御核酸酶等外界对内 染色体脱氧核糖核酸的因素的袭击末端复制问题 保护染色体结构和功能的完整性 染色体 染色体脱氧核糖核酸的末端复制问题 3 5 5 3 RNA引物 3 3 RNA引物水解 即DNA复制过程不能 自始至终 完整地复制整个线性染色体 而是每次都在其5 末端留下一个空缺未能填补 即RNA引物降解 如果细胞没有办法添补这些空隙 染色体DNA将随着每一次的细胞分裂而不断缩短 直至这种缺隙侵蚀到染色体的结构基因而使细胞消亡 领头链 随从链 5 5 1 纤毛原虫动物四膜虫 其巨核形成过程中 经历了端粒从无到有的发育过程 2 酵母外源脱氧核糖核酸转化酵母细胞后 在其末端形成新端粒的效率很高 5端粒的研究体系 1 早期的原始复制模型 2 端粒酶模型3 重组模型 6端粒的复制模型 端粒酶的结构与功能 酵母细胞 酵母细胞 酵母TS 四膜虫TS Shampay的加尾实验 1端粒酶的发现 Blackburn的实验 5 3 1 端粒的加尾方向是按GT链从5 端3 端 2 每次加一个重复单位 3 似为 无模板复制 4 被加尾的末端序列具有特异性 5 催化加尾的应是细胞抽提物中一种具有酶活性的物质 实验推论 2端粒酶的结构 1987年 Blackburn柱层析RNP结构 四膜虫端粒酶RNP 含有RNA组分和蛋白质组分 两者均为酶活性所必需 对RNA酶极为敏感 Telomerase http www apocalypse CAACCCCAA CAACCCCAA 端粒酶RNA 1 CAACCCCAA结构 有碱基修饰 2 反义RNA封闭 能抑制酶活性 反义RNA 3 Greider的点突变实验 点突变 端粒酶RNA序列 C A 端粒 端粒酶 C TTG C G C A T C 端粒酶蛋白质 1995年 首次从四膜虫克隆到端粒酶蛋白质组分 p80 p95 遗传密码 碱基互补 人类端粒酶蛋白质 核酸探针 TTGGGGTTGGGGTTGGGG 5 5 TTGGGGTTGGGGTTGGGG 5 TTGGGGTTGGGGTTGGGG 2 聚合 1 结合 3 移位 爬行模式 3端粒酶的功能 TTGGGG TTGGGG 末端补齐机制 5 GGGGTT GGGGTT n 端粒酶 5 G G配对回折 3 5 DNA聚合酶 4端粒酶活性的测定 1994年 Kim首创端粒重复扩增法 TRAP 陷阱的电泳检测 TS引物 CX引物 细胞提取物 端粒重复序列 T4g32 Rnasin TRAPbuffer dNTPs 细胞提取物 TS引物 TaqE CX引物 23 25 30min PCR仪 生物素 亲和素 地高辛 酶标仪检测 半定量 端粒 端粒酶与细胞衰老 Inhumanbloodcells thelengthoftelomeresrangesfrom8 000basepairsatbirthto3 000basepairsaspeopleageandaslowas1 500inelderlypeople Anentirechromosomehasabout150millionbasepairs Eachtimeacelldivides anaveragepersonloses30to200basepairsfromtheendsofthatcell stelomeres Inmostsomatictissues telomeraseisexpressedatverylowlevelsornotatall ascellsdivide telomeresshorten Shorttelomeresmaybeasignalforcellstosenesce stopdividing TelomeraseandSenescence 染色体 端粒 端粒 端粒与细胞存亡密切相关 端粒长短与细胞生命历程密切相关 染色体 端粒 端粒 细胞将停止分裂而趋于老化 1 培养细胞 端粒长度随分裂次数增多而缩短 端粒长度和细胞分化程度呈反比 2 人体 端粒平均长度随年龄增大而变短 体细胞端粒长度大大短于生殖细胞 相关实验证据 端粒酶与细胞存亡 端粒酶催化端粒不断延长 从而抵消因染色体复制 细胞分裂导致的脱氧核糖核酸缩短 使得染色体脱氧核糖核酸完好无损 细胞能够顺利地分裂繁殖 相关实验证据 1 四膜虫 端粒酶改变时端粒缩短 细胞死亡 2 酵母 端粒酶基因突变导致端粒变短 细胞衰老 端粒酶基因突变导致端粒变短 细胞衰老 培养细胞中端粒长度随分裂次数增多而缩短 端粒长度与细胞的年龄呈负相关 端粒长度和细胞分化程度呈反比 Estl突变体酵母活性下降 出现明显衰老 四膜虫端粒酶改变时端粒缩短 细胞死亡 体细胞端粒长度大大短于生殖细胞 端粒平均长度随生物体年龄增大而变短 正常人体细胞缺乏端粒酶活性 与其他有端粒酶活性的生物体细胞相比 人体细胞具有很长的端粒 人的胚胎细胞具有明显可探测的端粒酶活性 人的端粒与端粒酶 端粒染色体脱氧核糖核酸端粒 胚胎期 人体细胞中端粒酶合成和延长端粒的作用是在胚系细胞中完成的 当胚胎发育完成以后 端粒酶活性就被抑制 即在胚胎发育时期获得的端粒 应已足够维系人体的整个生命过程中因细胞分裂所致的端粒缩短 所以 当人体出生以后 染色体端粒就象是一个伴随着细胞分裂繁殖的 生命之钟 它历数着细胞可分裂的次数同时也见证了细胞由旺盛地生长繁殖到走向衰老死亡的整个生命历程 正常细胞 细胞分裂 细胞分裂 衰老死亡 细胞年轻化 抗衰老 端粒 端粒酶与恶性肿瘤 1996年 著名的端粒 酶 研究专家Blackburn和Greider在总结端粒 酶 研究历程中曾说过一句颇为耐人寻味的话 在自然界中 你永远也无法想象 海底中的一块岩石也许是一片生命的绿叶 公园里的一朵鲜花可能就是一株剧毒的恶虫 抗肿瘤靶点 TelomeraseandCancer Thepresenceoftelomeraseincancercellsallowsthemtomaintaintelomerelengthwhiletheyproliferate 1端粒酶活性特异表达于恶性细胞 正常细胞 良性肿瘤 恶性肿瘤 1994年 Kim创立 TRAP 法检测端粒酶活性 2端粒酶特异性表达于恶性细胞的成因 解释性研究 衰老死亡 诱导蛋白 端粒极度缩短 细胞死亡 细胞永生化 P53基因 Rb基因 介导细胞衰老 P53基因 Rb基因突变 细胞继续分裂至 危象期 大量细胞死亡少量细胞 永生化