《生物制药》酶类药物2

第三节 重要的酶类药物 超氧化物歧化酶是一种重要的氧自由基清除剂 作为药用酶在美国 德国 澳大利亚等国已有产品 由于SOD能专一性去除超氧阴离子自由基 故引起国内外生化界和医药界的极大关注 目前临床上应用集中在自身免疫性疾病上如类风湿关节炎 红斑性狼疮 皮肌炎等 三 超氧化物歧化酶 Superoxidedismutase SOD 稳定性对热稳定 天然牛血SOD可75 加热数分钟 对热稳定性与溶液离子强度有关对pH的稳定性 一般pH5 3 9 5较稳定 猪血SOD在pH7 6 9较稳定 吸收光谱 1 SOD的性质 结构特点 金属酶 Fe SOD Mw38000 2个亚基 每个亚基含1个Fe 存在于中 Cu Zn SOD Mw32000 2个亚基 每个亚基含1个Cu 1个Zn 存在于中 Mn SOD 原核细胞中 Mw40000 2个亚基 每个亚基1个Mn真核细胞中 Mw80000 4个亚基 每个亚基1个Mn 真核细胞 原核细胞 金属辅基与酶活性关系Cu Zn SOD Zn与分子结构有关 与催化活性无关 Cu与活性有关 对酶活力是必需的Mn SOD Mn对酶活力是必需的Fe SOD Fe对酶活力是必需的 2 生产工艺分离纯化SOD常根据原料 种类和性质的差异而有所不同 1 以牛血红细胞提取Cu Zn SOD的工艺 2 工艺过程 1 收集 浮选取新鲜牛血 离心除去血浆 2 溶血 去血红蛋白 干净红细胞加水溶血30min 然后加入0 25倍体积的乙醇和0 15倍体积的氯仿 搅拌15min 离心去血红蛋白 收集上清液 3 沉淀 热变性 将上述清液加入1 2 1 5倍体积的丙酮 产生大量絮状的沉淀 离心得沉淀物 再将沉淀物加适量水 离心去不溶物 上清液于60 70 热处理10分钟 离心去沉淀得浅绿色得澄清液 4 柱层析 洗脱 超滤浓缩 将上述澄清液超滤浓缩后小心加到已用2 5mmol L pH7 6磷酸缓冲液平衡好的DEAE sephadexA50柱上吸附 并用pH7 6的2 5 50mmol L的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱 收集具有SOD活性的洗脱液 5 冷冻干燥 2 以牛肝为原料提取Mn SOD的工艺 二 胃蛋白酶 Pepsin 胃蛋白酶 是一种消化性蛋白酶 由胃部中的胃粘膜主细胞 gastricchiefcell 所分泌 功能是将食物中的蛋白质分解为小的肽片段 胃蛋白酶也是第一个从动物身上获得的酶 自猪 牛 羊等胃粘膜提取的胃蛋白酶用作助消化药 常与稀盐酸同时用于幼畜消化不良性腹泻和慢性萎缩性胃炎 临床上主要用于因食蛋白过多 引起的消化不良及病后恢复期消化机能减退等 1 组成 结构 性质胃中惟一的一种蛋白水解酶 其最适pH值为1 2 胃蛋白酶作用的主要部位是芳香族氨基酸或酸性氨基酸的氨基所组成的肽键 药用胃蛋白酶是胃液中多种蛋白水解酶的混合物 含有胃蛋白酶 组织蛋白酶 胶原酶等 为粗制的酶制剂 性状 外观为淡黄色粉末 2 生产工艺 1 工艺路线 2 工艺过程 自溶 过滤在夹层锅内预先加水100L及盐酸 加热至50 时 加入200kg猪胃粘膜 快速搅拌使酸度均匀 保持45 48 消化3 4小时 用纱布滤去未消化的组织蛋白 收集滤液 脱脂 去杂质将滤液降温至30 以下 静防24 48h 使杂质沉淀除去 得到脱脂酶液 浓缩干燥取脱脂酶液 在40 以下浓缩到原体积的1 4 真空干燥 球磨 得到产品 三 尿激酶 Urokinase 尿激酶是一种碱性蛋白酶 由肾脏产生 主要存在于人和哺乳动物的尿中 人尿平均含有5 6U ml 临床上 尿激酶已经广泛应用于治疗各种新血栓形成或血栓梗塞疾病 1 组成性质 1 尿激酶有多种分子量形式 主要有31300 54700两种 尿中的尿胃蛋白酶原在酸性条件下可以激活生成尿胃蛋白酶 后者可以把分子量54700的天然尿激酶降解为分子量为31300尿激酶 2 尿激酶是专一性很强的蛋白水解酶 血纤维蛋白溶酶原是它唯一的天然蛋白质底物 它作用于精氨酸 缬氨酸键使得纤溶酶原转为纤溶酶 3 尿激酶的pI为pH8 9 2 生产工艺 1 工艺路线 2 工艺过程 收尿收集男性尿 沉淀处理尿液冷至10 以下 用NaOH调pH至8 5 静置1h 虹吸上清液 用盐酸调至pH5 0 5 5 硅藻土吸附处理好的尿液加入1 尿量的硅藻土 于5C下搅拌吸附1h 洗脱硅藻土吸附物洗涤装柱 先用0 02 氨水加0 1mol L氯化钠洗脱 当洗脱液油清变混时开始收集 除热源 去色素 CM C浓缩 透析除盐 四 L 天门冬酰胺酶 L asparaginase 天门冬酰胺酶是酰胺基水解酶 为抗肿瘤酶制剂 肿瘤细胞不能合成生长必需的天门冬酰胺而使其生长受到限制 正常细胞能合成天门冬酰胺 故受影响较少 因此 天门冬酰胺酶是一种对肿瘤细胞有选择性的抑制药物 L 天门冬酰胺酶为白色结晶粉末 微有湿性 易溶于水 不溶于甲醇 乙醇 丙酮 氯仿 乙醛 苯等有机溶剂 对热稳定性好 在温度50 下 15min后 活性降低30 60 下 1小时内失活 工艺路线 工艺过程 菌种培养大肠杆菌37 培养24h普通牛肉培养基 种子培养16 玉米浆 接种量1 1 5 37 通气搅拌培养4 8h 发酵罐培养玉米浆培养基 接种量8 37 通气搅拌培养6 8h 离心分离发酵液 得菌体 加2倍量丙酮搅拌 压滤 滤饼过筛 自然风干成菌体干粉 提取 沉淀 热处理每千克菌体干粉加入0 01mol LpH8的硼酸缓冲液10L37 搅拌1 5h 30 8mol L醋酸调节pH4 2 4 4 压滤 滤液加入2倍体积的丙酮 放置3 4h过滤 收集沉淀 自然风干 得干粗酶 取粗制酶 加入0 3 甘氨酸 调节pH8 8搅拌1 5h离心 上清液60 30min热处理 上清液加2倍体积的丙酮 析出沉淀 离心 收集酶沉淀 0 01mol L pH8磷酸缓冲液溶解 离心得上清酶溶液 精制 冻干调节pH8 8离心弃去沉淀 清液再调pH7 7加入50 聚乙二醇 浓度达到16 2 5 放置4 5天 离心得沉淀 蒸馏水溶解加4倍量的丙酮沉淀 同法反复1次 pH6 4 0 05mol L磷酸缓冲液溶解 50 聚乙二醇处理1次 即得无热原的L一天门冬酸胺酶 溶于0 8mol L磷酸缓冲液 在无菌条件下用6号垂熔漏斗过滤 分装 冷冻干燥制得注射用L一天门冬酸胺酶成品 每I支1万或2万单位 五 细胞色素C CytochromeC 细胞色素 来自三羧酸循环中产生的琥珀酸辅酶A 其肽链仅有104个氨基酸 体内大量存在 一般无需外源补充 且外源补充与体内含量相比甚微 细胞色素C是生物氧化的一个非常重要的电子传递体 在线粒体崤上与其它氧化酶排列成呼吸链 参与细胞呼吸过程 细胞色素C是中枢兴奋药 用于急救或辅助治疗各种原因引起的组织缺氧 如一氧化碳中毒 安眠药中毒 高山缺氧等 亦可用于脑缺氧 心肌炎 心肌代偿不全 心绞痛 心肌梗塞 肝炎 肾炎等 细胞色素种类较多 可以用光谱学 血红素基团的精确结构 抑制剂的敏感度以及还原电势的大小来分辨 根据辅基的不同 可以将细胞色素大致分为三类 细胞色素a血红素a 原血红素 细胞色素b血红素b 甲酰血红素 细胞色素d二氢卟酚 Chlorin 的衍生物细胞色素c 与其他三类细胞色素非共价结合血红素不同的是 细胞色素c通过分子中的半胱氨酸巯基与血红素共价结合 工艺路线 工艺过程 绞碎 提取 压滤取新鲜或冷冻猪心 去血块 脂肪和肌健等 绞肉机中绞碎 称取心肌碎肉 加1 5倍量蒸馏水搅拌均匀 用硫酸调pH4左右 常温搅拌提取压滤 滤液用氨水调节pH6 2 离心得提取液 心渣再加等量蒸馏水同上法重复提取1次 合并两次提取液 中和 吸附 洗脱提取液加氨水中和至pH7 5 在冰箱中静止沉淀杂蛋白 吸取上层清液 每升提取液加入10g人造沸石 搅拌吸附40min 静置倾去上层清液 收集吸附细胞色素C的人造沸石 用蒸馏水和氯化钠溶液反复洗涤 然后装柱 用25 硫酸氨溶液洗脱 得洗脱液 盐析 浓缩 透析洗脱液加入固体硫酸镀达到45 饱和度 使杂蛋白析出 过滤 收集透明滤液 缓缓加入20 三氯醋酸 边加边搅拌使细胞色素C沉淀析出 离心收集沉淀 再将沉淀溶于蒸馏水 装入透析袋中 透析至无硫酸根为止 过滤得细胞色素C粗品溶液 吸附 洗脱 透析粗品溶液通过处理好的AmberiteIRC 50 NH4 树脂柱吸附 然后将树脂移入大烧杯中 水洗至澄清为止 再分别上柱 用0 6mol L磷酸氢二钠与0 4mol L氯化钠混合液洗脱 洗脱液用蒸馏水透析去氯离子 得细胞色素C精品溶液 制剂取含相当于1 5g的细胞色素C精品液 加200mg亚硫酸氢钠 搅拌溶解再加双甘肽1 5g混合均匀 用氢氧化钠调节pH6 4左右 加注射用水100ml 过滤除热原 6号垂溶漏斗过滤 测含量 灌注 冷冻干燥 即得每支含15mg细胞色素C的制剂 习题1 酶成为药物应具备的条件 2