镉对光合的抑制作用 4.doc

乙烯信号转导阻断减轻Cd对拟南芥光合作用的抑制第4章讨论4.1Cd胁迫下对拟南芥生长与吸收Cd的影响根长、叶片大小、叶片颜色、根茎干湿重等，均为可衡量植物发育与生长的指标。在本论文中，对叶片大小进行了估量。Cd胁迫后，ein2-1突变体的叶片大小，比野生型的叶片大，也说明，突变体ein2-1与野生型相比，对Cd胁迫，有更大的抗性。4.2Cd胁迫下对拟南芥光合指标的影响4.2.1 对叶绿素含量的影响在Cd胁迫下，叶片中所含的叶绿素含量，其与光合作用有直接紧密的关联，同时，其也是抗重金属胁迫的重要的一个指标82。故本论文中对Cd胁迫后的野生型与ein2-1拟南芥的叶绿素含量进行了测量，并做了比较。结果显示，Cd胁迫后，野生型与ein2-1的叶绿素均被部分破坏，致使叶绿素含量有所下降，但ein2-1被破坏的程度，较对照野生植株来说，程度较低，也说明突变体ein2-1对Cd的抗性更强。4.2.2 对光合参数的影响(1)对净光合速率Pn的影响 净光合速率Pn可用来衡量光合特性，是一个重要的生理指标。由实验结果可以看出，ein2-1突变体净光合速率其下降程度较小且高于野生型。(2)对非光化学淬灭系数NPQ的影响非光化学淬灭为由于热耗散的原因，所导致的荧光淬灭，其值表明了植物将光能转化为热能的程度83。在Cd胁迫下，突变体ein2-1的NPQ低于对照野生型，即突变体ein2-1利用更多光能，将其用于光合作用，故相比于野生型对照植株，其光合效率更高。(3)对荧光参数的影响 在类囊体膜上，光合的光化学反应在此位置进行。其中，能直接说明光系统II光化学能力的指标为荧光参数的变化情况。初始荧光表示为F0，其值表明在不参与PSII下，光化反应所辐射的光能。Fv/Fm则表示原始所吸收的光能，其转化的效率。而Fv其可用来表示光系统II的光化活性大小，并与光系统II原初反应相关。Cd胁迫后，野生型对照的Fv/Fm下降程度，大于突变体ein2-1，原因可能为PSII有难以逆转的破坏，或者是有可逆失活出现，也可能为叶片中的结构如类囊体膜受到很多的损伤所致84。另外，在Cd胁迫后，野生型与突变体拟南芥的叶绿素含量均下降，也表明PSII受到严重的可逆失活或破坏，致使对类囊体膜同样受到损伤。而突变体ein2-1 Fv/Fm1其降低的程度，远低于野生型植株，也表明Cd胁迫对突变体ein2-1的PSII破坏程度小85。4.3Cd胁迫下对拟南芥光合基因表达的影响进行实时荧光定量PCR，以检测Cd胁迫处理下，拟南芥各相关基因的表达情况，依据基因的功能与作用，将其分为以下几类：叶绿素生物合成相关的基因(CHLH CHLI1 CHLI2 GSA2 HEMA1)、光合系统I相关的基因(LHCA2 PSAD PSAE PSAG PSAK PSAN)、光合系统II相关的基因(LHB1B1 PSBP1 PSBQ PSBR)、光合电子传递与ATP合成相关的基因(ATPC1 ATPD PETE1 PETM)。以下分别对各类基因表达结果进行说明。4.3.1对叶绿素生物合成相关的基因的影响对叶绿素生物合成相关的5个基因(CHLH、CHLI1、CHLI2、GSA2和HEMA1)的表达进行了分析。谷氨酰-tRNA合成谷氨酰-1-半醛，由谷氨酰 tRNA 还原酶所催化，此反应为植物体内Chl合成过程的一个限速反应86。在拟南芥中，此酶由三个基因所编码，包括AtHEMA1、AtHEMA2 和 AtHEMA3。有光条件下，AtHEMA1可被诱导，可在光合相关组织中所表达产生。AtHEMA2 和 AtHEMA3不是在光合组织中，而是根中所表达。提高ALA含量，可进一步使叶绿素含量增加，从而使植物的耐弱光性得到提高。谷氨酰-1-半醛合成5-氨基乙酰丙酸，由谷氨酸1半醛2,1氨基变位酶(GSA-AM)所催化，其由两个基因所编码，即GSA1 和 GSA2 87。结果表明，这五个基因，在Cd胁迫条件下，均下调表达了。前面对拟南芥的叶绿素含量也进行了检测，叶绿素含量在Cd胁迫下，也下降了，与这五个基因的表达情况相一致，表明Cd胁迫条件下，影响叶绿素生物合成相关基因的表达，从而使叶绿素含量下降。但同时应注意到，ein2-1不论在Cd胁迫处理之前还是Cd胁迫处理后，其叶绿素生物合成相关基因的表达与叶绿素含量均高于野生型拟南芥。4.3.2 对光合系统I相关的基因的影响对光合系统I相关的6个基因(LHCA2、PSAD、PSAE、PSAG、PSAK与PSAN)的表达进行了分析，这几个基因均为编码光系统I核心蛋白与光捕获蛋白成分。PSAN为位于内腔的电子供体质体蓝素提供可停泊的位点。PSAD与PSAE为位于类囊体膜的基质侧位置的铁氧还蛋白提供停泊位点。PSAG主要涉及到光系统I的反应中心的稳定过程，而PSAK则是参与相应状态迁移过程88。PS I的光捕获复合体，包含四个不同的叶绿素/类胡萝卜素结合多肽，即Lhca14。其中，PSAG可与LHCA1与LHCA4相结合，而PSAK则与LHCA2与LHCA3相结合89。结果表明，除PSAE之外，其他五个基因LHCA2、PSAD、PSAG、PSAK与PSAN，不论是野生型拟南芥还是ein2-1突变体植株，均表达下调了。野生型的PSAE在Cd胁迫后，表达下调了，而突变体ein2-1的PSAE的表达则上调了。但不论Cd胁迫前后，在突变体ein2-1中，此六个基因的表达量均高于野生型。虽然除PSAE外，其余五个基因均下调了，但在Cd胁迫条件下这五个基因在突变体ein2-1在中的表达，与未Cd胁迫前处理的野生型拟南芥的表达情况相近。通过上述实验数据，可表明，乙烯信号转导阻断突变体对Cd胁迫的耐受性与光系统I复合物的保护相关。4.3.3 对光合系统II相关的基因的影响对光合系统II相关的4个基因(LHB1B1 PSBP1 PSBQ PSBR)的表达进行了分析。PSBP1与PSBQ是光系统II中的放氧复合体中的蛋白组分，其中，PSBQ作用于植物叶绿体中的NAD(P)H脱氢酶复合体，PSBP1则是在光系统II的光损伤的修复过程中有重要作用90。LHB1B1是光系统II中的一个光捕获复合体蛋白。PSBR是光系统II中一个核心蛋白，如果此蛋白发生异常，在植物正常生长过程中，氧释放过程则会受到严重影响91。结果表明，与光系统I中的除PSAE之外的五个基因的表达情况相同，在Cd胁迫处理后，相比于未Cd胁迫的植株，LHB1B1、PSBP1、PSBQ与PSBR的表达均下调，且下调程度相比于光系统I中的5个基因，其程度更明显，说明在Cd胁迫处理下，光系统II相关基因的表达相比于光系统I相关基因的表达，对Cd胁迫更敏感。由光系统I与光系统II相关基因的差异表达，也可说明，在胁迫条件下，光系统I比光系统II有更高和更好的稳定性，抗逆性更强。本论文中，所检测的这四个与光系统II相关基因的表达情况，与前面所检测到的野生拟南芥与突变体ein2-1的f Fv/Fm and PSII的变化，表明乙烯信号转导阻断突变体对Cd胁迫的耐受性与光系统II复合物的保护相关。4.3.4 对光合电子传递与ATP合成相关的基因的影响对光合电子传递与ATP合成相关的4个基因(ATPC1 ATPD PETE1 PETM)的表达进行了分析。ATPC1 编码ATP合酶 的亚基。ATPD编码ATP合酶 的亚基，对ATP合酶功能的正常进行时必要的。PETE1是编码质体蓝素两个基因中的一个基因，是一个铜结合蛋白，在植物光合作用的直线型与环形的电子传递过程中，有至关重要的作用。相关研究表明，在拟南芥中，pete1/pete2双突变体植株，因为不能进行光驱动的电子传递过程，因而不能进行光合自氧的正常生长92。 PETM编码cyt-b6f复合体的一个亚基，其表达受光合作用过程中电子传递链的氧化还原信号的调控93。结果表明，除PETE1表达上调外，其它三个基因ATPC1、ATPD、PETM的表达均下调。PETM的表达，在Cd胁迫的ein2-1突变体中，表达情况未发生改变，野生型拟南芥PETM的表达则明显下调了。野生型拟南芥的PETE1，在Cd胁迫处理的前后，表达情况未发生改变，与Cd胁迫前的突变体ein2-1的表达水平相当。但是突变体ein2-1的PETE1在Cd胁迫处理后，则是明显上调表达了。以上实验数据也说明，与光合电子传递相关的基因表达水平相对偏高了，其可以吸收更多的光能，用于光化学反应的进行，由上面所检测到的荧光系数PSII的改变，可以得到印证。与ATP合成相关基因ATPC1、ATPD的表达，在Cd胁迫后，均有不同程度的下降。光合电子传递相关的基因PETE1与PETM的表达，一个没有变化一个表达上调，与ATP合成相关基因ATPC1、ATPD的表达情况相反，即说明在Cd胁迫处理下，ATP合成相关基因与光合电子传递相关的基因并不是被协同调控的。ATP合酶含量与细胞色素b6f复合体能力相关，而且这种平衡对电子和质子转移反应的协同调节是至关重要的。研究也表明，ATP合酶受亚基上的形成二硫键的半胱氨酸残基的翻译后修饰所调控，且其受来自PS I中的光诱导的电子流所调控94。有研究表明，在面对非生物因素的胁迫时，如湿度、温度、盐胁迫条件时，植物体内的亚基与亚基的丰度会受到影响，与植物对胁迫的抗性呈相关的联系，抗性大时亚基含量会上升，抗性低时其含量则会相应下降95。维持ATP合酶的丰度与活性对植物对外界因素的抗胁迫过程中有至关重要的作用。而本论文中，突变体ein2-1的ATPC1、ATPD在Cd胁迫处理后，其表达量高于野生型拟南芥，也说明，ein2-1拟南芥植株相比于野生型拟南芥，对Cd胁迫有更强的耐受性。4.4Cd胁迫下对拟南芥碳代谢的影响磷酸戊糖途径与淀粉酶降解途径相关的基因(AMY3 BAM3 G6PD5 PGD1 PRI2 TKL2)和卡尔文循环与光呼吸作用相关的基因(rBCS1A AGT3)。以下对各相关基因的表达结果进行说明。4.4.1磷酸戊糖途径与淀粉降解途径相关的基因对磷酸戊糖途径与淀粉酶降解途相关的6个基因(AMY3、BAM3、G6PD5、PGD1 、PRI2、TKL2)的表达进行了分析。G6PD5和PGD1分别编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶，可催化仅需两步脱氢反应的磷酸戊糖途径，以产生NADPH96。这也表明葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶，这两个酶在植物应对外界胁迫的应答中，扮演者至关重要的角色，因为NADPH可以广泛的参与植物的代谢过程，如植物中还原态谷胱甘肽的形成，而还原态谷胱甘肽在植物应对氧化应激发生时有很重要的作用97 98。除此之外，磷酸戊糖途径与卡尔文循环过程可共享很多的中间代谢物与酶，因此，磷酸戊糖途径与二氧化碳的同化过程密切相关，也可以为植物的生物合成途径提供一些NADPH还原力，尤其是在不能进行光合作用的植物组织与植物处于黑暗环境中时99 100 101。另外，磷酸戊糖途径还能为核苷酸合成、芳香氨基酸合成，和植物应对外界环境变化所产生的的次级代谢产物如苯丙脂类以及他们的化合物提供碳骨架102。由上述实验数据可知，Cd胁迫处理后，G6PD5和PGD1在野生型拟南芥中，分别为其为表达无变化与表达表达下调。而在突变体ein2-1中，在Cd胁迫处理后，G6PD5和PGD1的均表现为显著的表达上调，依据上面的分析，即植物有更多的NADPH被产生，以应对Cd胁迫的应激环境，避免植物本身受到Cd元素的危害。PRI2编码产生核糖-5-磷酸异构酶，在磷酸戊糖途径的无氧阶段，发挥重要的作用103。在拟南芥的基因组上，已经找到可能编码核糖-5-磷酸异构酶的四个基因。将PRI2在植物基因组上敲除后，对植物自身生长产生了多效性的影响，如相比于野生植株，在短日照条件下，其开花期延长了，引起早熟等现象104。由上述实验数据可知，Cd胁迫处理后，PRI2在野生型拟南芥中，其为表达几乎无变化。而在突变体ein2-1中，在Cd胁迫处理后，PRI2表现为显著的表达上调。叶绿体转酮酶涉及多个植物体内反应，如磷酸戊糖途径、糖酵解途径与卡尔文循环途径。在拟南芥基因组上，有编码叶绿体转酮酶的两个同源基因，即TKL1 and TKL2。之前，有研究者表明，在非生物胁迫条件处理后，如Cd胁迫处理后，TKL蛋白的表达水平会显著的上调105。由上述实验数据可知，Cd胁迫处理后，TKL2在野生型拟南芥中，为其为表达显著上调。在突变体ein2-1中，在Cd胁迫处理后，TKL2也表现为显著的表达上调。由此，可作出推断，拟南芥植株对Cd胁迫的耐受性与碳代谢网络有关联。最后，对与淀粉降解途径有关的两个基因AMY3与BAM3，它们的基因表达情况进行了检测。AMY3编码-淀粉酶，BAM3编码-淀粉酶。结果表明，Cd胁迫处理后，BAM3在野生型拟南芥中，其为表达几乎无变化。而在突变体ein2-1中，在Cd胁迫处理后，PRI2的均表现为显著的表达上调。而Cd胁迫处理后，AMY3在野生型拟南芥中，其为表达显著上调。在突变体ein2-1中，在Cd胁迫处理后，AMY3也表现为显著的表达上调。作为光合作用的一个短暂出现的产物，淀粉可被重新活化，用来维持植物正常的代谢过程，如在缺少光照条件下与在胁迫应激条件下，可谓植物提供能量与碳骨架，保证植物正常生活的需要106。在拟南芥植株中，含有三种-淀粉酶的异构酶，即AMY1、AMY2与AMY3。在这三个酶中，只有AMY3中含有叶绿体转运多肽，并且定位于叶绿体细胞器中107。在Cd胁迫下，AMY3的表达上调，由上面数据分析，推测在Cd胁迫条件下，淀粉降解途径与植物应对胁迫条件密切相关。在淀粉降解途径中，麦芽糖的产生只能由-淀粉酶所催化。在拟南芥的基因组中，已经发现有九个基因可编码-淀粉酶，将它们命名为BAM1-9。在这九个基因中，BAM3被发现在植物夜间或者黑暗条件下，参与淀粉降解途径108。在本论文中，所检测的这两个与淀粉降解相关的酶，AMY3与BAM3，它们的表达情况在Cd胁迫前后是类似的，有一致性。同时，应该注意到的是，在体外条件下，-淀粉酶可以激活AMY3基因的表达，表明这两个基因在淀粉降解途径中，可以协同叶绿体中的反应。4.4.2 卡尔文循环与光呼吸作用相关的基因对卡尔文循环与光呼吸作用相关的2个基因(RBCS1A、AGT3)的表达进行了分析。Rubisco，为核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶，催化两种竞争反应，即光合作用的卡尔文循环过程中二氧化碳的固定反应，与光呼吸过程中的2-磷酸乙醇酸的产生反应109 110。在拟南芥植株中，已经发现四个编码Rubisco的基因，其中，RBCS1A对植物的Rubisco的累积有很重要的促进作用。许多研究表明，许多的非生物因素通过对植物体的Rubisco造成影响，进而形成环境胁迫，从而影响植物的正常的生长过程111。例如，一些非生物因素，如盐胁迫、臭氧胁迫与紫外线B辐射胁迫等，可以很明显降低植物体中的Rubisco的含量，从而危害植物的光合作用正常的进行112。而在干旱与高温环境下，Rubisco活化酶的表达水平与功能被或多或少的影响，从而导致Rubisco活性的下降。 RBCS1A 与光合速率的这种关联也揭示了植物光合速率的改变与一些关键基因的表达密切相关。因此，未来的研究可以集中在对反式作用元件、顺式作用因子、信号转导途径等的阐明方面113。结果表明，不论野生型还是突变体拟南芥，RBCS1A的表达在Cd胁迫后，均有所降低。而在本论文前面，对植物中二磷酸核酮糖羧化酶的酶活数据的测定中，突变体ein2-1不管在Cd胁迫前后，其二磷酸核酮糖羧化酶的酶活几乎是没有变化的，而野生型拟南芥的二磷酸核酮糖羧化酶的酶活在Cd胁迫处理后，则是显著降低了。从中可反映出，相比于野生型拟南芥，ein2-1突变体植株的二磷酸核酮糖羧化酶的酶活受Cd胁迫影响小，从而减轻了Cd胁迫对拟南芥光合作用的抑制作用，对Cd胁迫有更大的耐受的能力。AGT3可编码丙氨酸：乙醛酸氨基转移酶，在植物的光呼吸过程中起着很重要的作用。在Cd胁迫处理后，野生型拟南芥植株AGT3的表达，相比于Cd处理之前，几乎没有什么变化。突变体ein2-1植株在Cd胁迫处理前，其AGT3的表达水平与野生型拟南芥Cd胁迫处理之前与Cd处理之后的表达水平相当，但突变体ein2-1的