基因工程制胰岛素(生工版)

2020 4 6 1 用基因工程方法获得胰岛素 第四组 2020 4 6 2 胰岛素是由胰岛B细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖 乳糖 核糖 精氨酸 胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素 胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素 同时促进糖原 脂肪 蛋白质合成 外源性胰岛素主要用来糖尿病治疗 胰岛素这类活性蛋白多肽和细胞因子具有高度生物活性 分子量很大 立体结构异常复杂 体外难以人工合成 所以过去糖尿病患者只能服用从牛 猪体中提取的胰岛素来治疗 但牛 猪胰岛素结构上与人胰岛素有差别 如与猪胰岛素B链第30个氨基酸残基不同 长期服用会引起肾和眼的疾病 故必需要用基因工程方法获得重组人胰岛素进行治疗 2020 4 6 3 基因工程制胰岛素三种方法 一 A链和B链分别表达法 化学合成A链和B链的编码序列 2020 4 6 4 基因工程制胰岛素三种方法 一 A链和B链分别表达法 表达产物的后期处理路线 2020 4 6 5 基因工程制胰岛素三种方法 二 人胰岛素原表达法 基因工程菌的构建战略 2020 4 6 6 基因工程制胰岛素三种方法 二 人胰岛素原表达法 表达产物的后期处理路线 2020 4 6 7 基因工程制胰岛素三种方法 三 A链和B链同时表达法 2020 4 6 8 方法一 由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基 体外二硫键的正确配对率较低 通常只有10 20 因此成本高 方法二 胰岛素原能形成良好的空间构象 三对二硫键的正确配对率提高 折叠率高 工艺路线依然繁琐 方法三 需体外折叠 基因工程制胰岛素三种方法 三种方法比较 2020 4 6 9 基因工程获取胰岛素的步骤 一 获取外源目的基因片段二 选择与获取表达载体三 重组目的DNA片段与表达载体四 选择与获取表达细胞五 重组体导入表达细胞六 对重组体细胞进行筛选纯化鉴定七 工程菌产物鉴定和保存八 发酵培养 2020 4 6 10 一 获取外源目的基因片段 1 选择实验材料2 提取RNA 分离RNA3 逆转录mRNA 得cDNA第一链4 得双链DNA5 DNA序列纠错6 目的基因通过细胞克隆扩增7 目的基因回收及DNA测序 最终目的基因获取 2020 4 6 11 一 获取外源目的基因片段 1 选择实验材料胰岛素是一种蛋白质类激素 体内胰岛素是胰岛B细胞 即胰岛 细胞 受内源性或外源性物质如葡萄糖 乳糖 核糖 精氨酸 胰高血糖素等的刺激而分泌的 胰岛素基因只有在胰岛B细胞中才能转录出信使RNA 所以用基因工程方法生产胰岛素时 选用胰岛B细胞为获取目的基因的实验材料 2020 4 6 12 一 获取外源目的基因片段 2 提取RNA 分离RNA2 1总RNA的提取2 2mRNA的纯化2 3mRNA的保存 2020 4 6 13 一 获取外源目的基因片段 2 1总RNA的提取总RNA的抽提方法有多种 TRIzol试剂是使用组广泛的RNA抽提试剂 主要由苯酚和异硫氰酸胍组成 可以迅速破坏细胞结构 使存在于细胞质及核内的RNA释放出来 并使核糖体蛋白与RNA分子分离 苯酚虽可有效地变性蛋白质 但不能完全抑制RNA酶活性 因此TRIzol中还加入了8 羟基喹啉 异硫氰酸胍 巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase RNA酶 TRIzol是从细胞和组织中提取总RNA的即用型试剂 在样品裂解或匀浆过程中 TRIzol能保持RNA完整性 提取RNA时 首先用液氮研磨材料 匀浆 加入TRIzol试剂 进一步破碎细胞并溶解细胞成分 然后加入氯仿抽提 离心 分离水相和有机相 收集含有RNA的水相 通过异丙醇沉淀 可获得比较纯的总RNA 用于下一步mRNA的纯化 2020 4 6 14 一 获取外源目的基因片段 2 1 1TRIzol法提取流程 1 样品处理 培养细胞 收获细胞1 5 10 7 移入1 5ml离心管中 加入1mlTRIzol 混匀 室温静置5min 组织 取50 100mg组织 新鲜或 70 及液氮中保存的组织均可 置1 5ml离心管中 加入1mlTRIzol充分匀浆 室温静置5min 2 加入0 2ml氯仿 振荡15s 静置2min 3 4 离心 12000g 15min 取上清液 4 加入0 5ml异丙醇 将管中液体轻轻混匀 室温静置10min 5 4 离心 12000g 10min 弃上清液 6 加入1ml75 乙醇 轻轻洗涤沉淀 4 7500g 5min 弃上清液 7 晾干 加入适量的DEPCH2O溶解 65 促溶10 15min 2020 4 6 15 一 获取外源目的基因片段 2 1 1TRIzol法提取流程图 2020 4 6 16 一 获取外源目的基因片段 2 2mRNA的纯化该方法利用mRNA3 端含有PolyA 多聚腺苷酸 的特点 当RNA流经寡聚dT纤维素柱时 在高盐缓冲液的作用下 mRNA被特异性的结合在柱上 再用低盐溶液或蒸馏水洗脱mRNA 经过两次寡聚纤维柱后可得到较高纯度的mRNA 2020 4 6 17 一 获取外源目的基因片段 2 2 1寡聚 dT 纤维素柱纯化mRNA 1 试剂准备 3M醋酸钠 pH5 2 0 1MNaOH 上样缓冲液 20mMTris HCl pH7 6 0 5MNaCl 1MEDTA pH8 0 0 1 SLS 十二烷基氨酸钠 配制时可先配制Tris HCl pH7 6 NaCl EDTA pH8 0 的母液 经高压消毒后按各成分确切含量 经混合后再高压消毒 冷却至65 加入经65 温育 30min 的10 SLS至终浓度为0 1 洗脱缓冲液 10mMTris HCl pH7 6 1mMEDTA pH8 0 0 05 SDS 无水乙醇 70 乙醇 DEPC 0 1 焦炭酸二乙酯 2020 4 6 18 一 获取外源目的基因片段 2 2 1寡聚 dT 纤维素柱纯化mRNA 2 操作步骤 将0 5 1 0g寡聚 dT 纤维悬浮于0 1M的NaOH溶液中 用DEPC处理的1ml注射器或适当的细管 将寡聚 dT 纤维素装柱0 5 1ml 用3倍柱床体积的DEPCH2O洗柱 使用1 上样缓冲液洗柱 直至洗出液pH值小于8 0 将RNA溶解于DEPCH2O中 在65 中温育10min左右 冷却至室温后加入等体2 上样缓冲液 混匀后上柱 立即收集流出液 当RNA上样液全部进入柱床后 再用1 上样缓冲液洗柱 继续收集流出液 将所有流出液于65 加热5min 冷却至室温后再次上柱 收集流出液 用5 10倍柱床体积的1 上样缓冲液洗柱 每管1ml分步收集 OD260测定RNA含量 前部分收集管中流出液的OD260值很高 其内含物为无polyA尾的RNA 后部分收集管中流出液的OD260值很低或无吸收 用2 3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱poly A RNA 分步收集 每部分为1 3 1 2柱体积 OD260测定poly A RNA分布 合并含poly A RNA的收集管 加入1 10体积3MNaAc pH5 2 2 5倍体积的预冷无水乙醇 混匀 20 放置30min 4 离心 10000g 15min 小心吸弃上清 用70 乙醇洗涤沉淀 4 离心 10000g 5min 弃上清 室温晾干 用适量的DEPCH2O溶解RNA 2020 4 6 19 一 获取外源目的基因片段 2 2 1寡聚 dT 纤维素柱纯化mRNA 3 注意事项 整个实验过程必须防止Rnase的污染 步骤 中将RNA溶液置65 中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个 一个是破坏RNA的二级结构 尤其是mRNApoly A 尾处的二级结构 使poly A 尾充分暴露 从而提高poly A RNA的回收率 另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合 否则会导致rRNA的污染 所以此步骤不能省略 十二烷基肌氨酸钠盐在18 以下溶解度下降 会阻碍柱内液体流动 若室温低于18 最好用LiCl替代NaCl 寡聚 dT 纤维素柱可在4 贮存 反复使用 每次使用前应该依次用NaOH 灭菌ddH2O 上样缓冲液洗柱 一般而言 107哺乳动物培养细胞能提取1 5 gpoly A RNA 约相当于上柱总RNA量的1 2 2020 4 6 20 一 获取外源目的基因片段 2 3mRNA的保存用少量水溶解mRNA 即可用于cDNA合成或保存在70 乙醇中并于 70 下贮存 2020 4 6 21 一 获取外源目的基因片段 胰岛素基因mRNA序列 2020 4 6 22 一 获取外源目的基因片段 胰岛素基因mRNA序列 NCBI中搜索得 2020 4 6 23 一 获取外源目的基因片段 3 逆转录mRNA 得cDNA第一链mRNA在反转录酶的作用下由引物引导合成cDNA 加入高浓度的Oligo dT 引物 Oligo dT 引物与mRNA的3 末端的poly A 配对 引导反转录酶以mRNA为模板合成第一链cDNA 这种cDNA合成的方法在cDNA文库构建中应用极为普遍 其缺点主要是由于cDNA末端存在较长的poly A 而影响cDNA测序 原因 oligo dT 结合在mRNA的3 端 因此合成全长的cDNA需要反转录酶从mRNA分子的一端移动到另一端 有时这种全合成难以达到 2020 4 6 24 一 获取外源目的基因片段 4 得双链DNA4 1合成cDNA第二链得双链DNA4 2将DNA双链通过PCR技术进行扩增 2020 4 6 25 一 获取外源目的基因片段 4 1合成cDNA第二链得双链DNAmRNA cDNA杂合双链中的mRNA链在RNA酶H作用下先形成很多切口 mRNA链就被切割成很多的小片段 这些小片段为大肠杆菌DNA聚合酶 提供了合成第二链的引物 大肠杆菌DNA聚合酶 以第一链cDNA为模板合成一段段互补的cDNA片段 这些cDNA片段进而在DNA连接酶的作用下连接成一条链 即cDNA的第二链 遗留在5 末端的一段很小的mRNA也被大肠杆菌DNA聚合酶 的5 3 核酸外切酶和RNA酶H降解 暴露出与第一链cDNA对应的3 端部分序列 同时 大肠杆菌DNA聚合酶 的3 5 核酸外切酶的活性可将暴露出的第一链cDNA的3 端部分消化掉 形成平端或差不多的平端优点 a 合成cDNA的效率高b 直接利用第一链的反应产物 不需纯化c 避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA 2020 4 6 26 一 获取外源目的基因片段 4 1合成cDNA第二链得双链DNA 2020 4 6 27 一 获取外源目的基因片段 4 2将DNA双链通过PCR技术进行扩增4 2 1模板DNA的变性向离心管加入 模板 引物 耐热的DNA聚合酶 PCR缓冲液 500mm01 LKCl 100mmol LTris一HCl pH8 4 150mmol LMgCl2 lmg m1明胶 5mmo1 LdNTP贮备液 然后加热至93 左右一定时间后 使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离 使之成为单链 以便它与引物结合 为下轮反应作准备 2020 4 6 28 一 获取外源目的基因片段 4 2将DNA双链通过PCR技术进行扩增4 2 2模板DNA与引物的退火 复性 模板DNA经加热变性成单链后 温度降至55 左右 引物与模板DNA单链的互补序列配对结合 2020 4 6 29 一 获取外源目的基因片段 4 2将DNA双链通过PCR技术进行扩增4 2 3引物的延伸DNA模板 引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下 以dNTP为反应原料 靶序列为模板 按碱基配对与半保留复制原理 合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链 重复循环变性 退火 延伸三过程 就可获得更多的 半保留复制链 而且这种新链又可成为下次循环的模板 每完成一个循环需2 4分钟 2 3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍 2020 4 6 30 一 获取外源目的基因片段 5 目的基因回收纯化及DNA测序纠错5 1将目的基因进行回收纯化5 2对目的基因进行测序5 3DNA序列纠错 2020 4 6 31 一 获取外源目的基因片段 5 1将目的基因进行回收纯化1 在PCR试管中加入凝胶缓冲液进行琼脂糖凝胶电泳电泳到适当位置后在目的DNA条带的前端挖一长方形槽 向槽中加入融化的低熔点胶 待凝固后进行电泳 2 当DNA进入低熔点胶中心时停止电泳 紫外灯下切下目的条带的低熔点胶 3 将切下的胶放到离心管中 加入200 的 缓冲液 65 温浴3分钟以融化低熔点胶 4 然后分别用酚 氯仿 氯仿抽提一次 取上清 加入2倍体积的无水乙醇 20 沉淀DNA2h以上 12000rpm离心15min 弃上清 用70 乙醇洗涤 吹干后溶于10 l无菌水中 注意事项 在紫外灯下切出含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶时应注意要快速操作 以免损伤 2020 4 6 32 一 获取外源目的基因片段 5 2对目的基因进行测序利用DNA聚合酶 以待测单链DNA为模板 以dNTP为底物 设立四种相互独立的测序反应体系 在每个反应体系中加入不同的ddNTP作为链延伸终止剂 在测序引物引导下 按照碱基配对原则 每个反应体系中合成一系列长短不一的引物延伸链 通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 放射自显影检测后 从凝胶底部到顶部按5 至3 方向读出新合成链序列 由此推知待测模板链的序列 2020 4 6 33 一 获取外源目的基因片段 5 2对目的基因进行测序 2020 4 6 34 一 获取外源目的基因片段 5 3DNA序列纠错1 将待突变基因克隆到突变载体上 2 制备含突变基因的单链模板 3 人工合成一段改变了碱基顺序的寡核苷酸片段 以此作为引物 在体外合成互补链 获得含有错配碱基的完整双链M13DNA4 转化和初步筛选异源双链DNA分子转化大肠杆菌后 产生野生型 突变型的同源双链DNA分子 5 用诱变的寡核苷酸引物作为探针 通过杂交即可鉴定出突变体 2020 4 6 35 一 获取外源目的基因片段 6 目的基因通过细胞克隆扩增6 1目的基因与运载体结合6 2将目的基因导入受体细胞并使之扩增6 3筛选获得了重组DNA分子的受体细胞克隆 2020 4 6 36 一 获取外源目的基因片段 6 1目的基因与运载体结合用与提取目的基因相同的限制酶切割质粒使之出现一个切口 将目的基因插入切口处 让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对 在连接酶的作用下连接形成重组DNA分子 2020 4 6 37 一 获取外源目的基因片段 6 2将目的基因导入受体细胞并使之扩增要让目的基因表达 必须将它导入受体细胞并进行扩增 为获得目的基因的表达产物时 通常以大肠杆菌等无害易得的细菌为受体 注意 为改进某种生物时 将欲改进的生物细胞为受体 为使重组的DNA分子更容易进入受体细胞 通常还要用一些物质对受体细胞进行处理 使受体细胞具有更大的通透性 例如改变PH值 加入氯化钙等 2020 4 6 38 一 获取外源目的基因片段 6 3筛选获得重组DNA分子的受体细胞克隆前几步的处理十分繁锁 为保证目的基因得到有效利用 通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基因 这样 处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少 必须将它从中检测出来 细菌的检测 将每个受体细胞单独培养形成菌落 检测菌落中是否有目的基因的表达产物 淘汰无表达产物的菌落 保留有表达产物的进一步培养 研究 多细胞生物的检测 将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体 检测这些个体是否摄入目的基因 摄入的基因是否表达 是否表现出相应的性状 2020 4 6 39 一 获取外源目的基因片段 7 目的基因回收及DNA测序 最终目的基因获取7 1内容物释放将培养物加入试管 加入EDTA及去污剂 用碱处理细菌 使细菌的细胞壁破裂 释放出细胞内容物 在强碱环境下 宿主菌的线性双链DNA片段中的氢键断裂 双链解离变性 而质粒DNA共价闭合环状的双链并不完全分离 2020 4 6 40 一 获取外源目的基因片段 7 目的基因回收及DNA测序 最终目的基因获取7 2加酸 离心然后加入高浓度酸性盐 PH恢复至中性 变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物 而质粒DNA又恢复天然构型 能溶解在上清液中 通过离心把染色体DNA 蛋白质 SDS复合物等一起除去 2020 4 6 41 一 获取外源目的基因片段 7 目的基因回收及DNA测序 最终目的基因获取7 3切割 电泳利用限制性内切酶特异的识别DNA特异的核苷酸序列 并切割DNA 产生一定长度的DNA片段 通过电泳对酶切前后产物分析可以鉴别目的基因 2020 4 6 42 一 获取外源目的基因片段 7 目的基因回收及DNA测序 最终目的基因获取7 4回收纯化 测序对目的基因进行回收纯化 再测序 2020 4 6 43 二 表达载体的构建 pET28a 含有T7噬菌体启动子 乳糖操纵子 核糖体结合位点 His6标签序列 凝血酶切割位点 多克隆位点 T7噬菌体终止子 乳糖阻遏序列 pBR322复制子ori fl噬菌体复制子 卡那霉素筛选标记序列等 2020 4 6 44 二 表达载体的构建 2020 4 6 45 原因 1 T7噬菌体启动子 核糖体结合位点等引导目的基因高效转录和翻译 2 乳糖操纵子和乳糖阻遏序列存在的意义主要在于 当目的蛋白对大肠杆菌有毒性的时候 可以通过添加阻遏物 控制目的蛋白以较低水平表达 3 His6标签序列 凝血酶切割位点存在的意义主要在于方便利用针对His6的整合层析分离纯化蛋白 然后利用凝血酶去除切割标签蛋白 4 卡那霉素抗性基因编码的氨基糖苷磷酸转移酶 对卡那霉素进行修饰 阻断其与核糖体结合作用 二 表达载体的构建 2020 4 6 46 三 重组目的DNA片段和表达载体 用T7噬菌体DNA连接酶将质粒载体pET28a经EcoR 和BamH 酶切的片段与目的基因经EcoR 和BamH 酶切的片段连接起来 构成重组DNA分子 使用双酶切 DNA分子重组时为了保证目的片段以正确的方向连接进入载体 往往尽可能选择两种具有不同黏性末端的酶分别酶切目的DNA分子和载体 这种双酶切虽然使载体和目的DNA都产生两种不同的黏性末端 但是连接酶会选择把相同的黏性末端连接起来 从而保证目的基因只以一个方向连接入载体 2020 4 6 47 四 选择与获取表达细胞 1 选择大肠杆菌2 培养大肠杆菌 2020 4 6 48 四 选择与获取表达细胞 1 选择大肠杆菌原因 1 繁殖迅速 培养简单 操作方便 遗传稳定2 基因克隆及表达系统成熟完善3 全基因组测序完成 共有4405个开放性阅读框架4 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物 2020 4 6 49 四 选择与获取表达细胞 开放阅读框 ORF 是生物个体的基因组中 可能是蛋白质编码序列的部分 基因中的ORF包含并位于开始编码与终止编码之间 由于一段DNA或RNA序列有多种不同读取方式 因此可能同时存在许多不同的开放阅读框架 开放阅读框包含一段可以编码蛋白的碱基序列 不能被终止子打断 2020 4 6 50 2 大肠杆菌的培养 1 LB Luria Bertain 液体培养基配制精解蛋白胨 bacto tryptone 1 0 酵母浸出粉 bacto extract 0 5 氯化钠1 0 搅拌使之完全溶解 用5molNaOH about0 2ml 1000ml培养基 调pH至7 0 如用进口试剂可不必调 高压灭菌20min 120 0 1Mpa 四 选择与获取表达细胞 2020 4 6 51 四 选择与获取表达细胞 2 牛肉膏蛋白胨培养基组成成分 牛肉膏3g 蛋白胨10g Nacl5g 琼脂15 20g 水1000mL PH7 4 7 6 具体配置步骤 1 称药品按实际用量计算后 按配方称取各种药品放入大烧杯中 牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量 用热水溶解后倒入大烧杯 也可放在称量纸上称量 随后放入热水中 牛肉膏使与称量纸分离 立即取出纸片 蛋白胨极易吸潮 故称量时要迅速 2020 4 6 52 四 选择与获取表达细胞 具体配置步骤 2 加热溶解在烧杯中加入少于所需要的水量 然后放在石棉网上 小火加热 并用玻棒搅拌 待药品完全溶解后再补充水分至所需量 若配制固体培养基 则将称好的琼脂放入己溶解的药品中 再加热融化 此过程中 需不断搅拌 以防琼脂糊底或溢出 最后补足所失的水分 3 调pH检测培养基的pH 若pH偏酸 可滴加lmol LNaOH 边加边搅拌 并随时用pH试纸检测 直至达到所需pH范围 若偏碱 则用lmol LHCl进行调节 pH的调节通常放在加琼脂之前 应注意pH值不要调过头 以免回调而影响培养基内各离子的浓度 2020 4 6 53 四 选择与获取表达细胞 具体配置步骤 4 过滤液体培养基可用滤纸过滤 固体培养基可用4层纱布趁热过滤 以利培养的观察 但是供一般使用的培养基 这步可省略 5 分装按实验要求 可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内 分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染 分装量 固体培养基约为试管高度的l 5 灭菌后制成斜面 分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜 半固体培养基以试管高度的1 3为宜 灭菌后垂直待凝 2020 4 6 54 四 选择与获取表达细胞 具体配置步骤 6 加棉塞试管口和三角瓶口塞上用普通棉花 非脱脂棉 制作的棉塞 棉塞的形状 大小和松紧度要合适 四周紧贴管壁 不留缝隙 才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用 要使棉塞总长约3 5塞入试管口或瓶口内 以防棉塞脱落 有些微生物需要更好的通气 则可用8层纱布制成通气塞 有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞 7 包扎加塞后 将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸 以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞 若培养基分装于试管中 则应以5支或7支在一起 再于棉塞外包一层牛皮纸 用绳扎好 然后用记号笔注明 培养基名称 组别 日期 2020 4 6 55 四 选择与获取表达细胞 具体配置步骤 8 灭菌将上述培养基于121 3 湿热灭菌20min 如因特殊情况不能及时灭菌 则应故人冰箱内暂存 9 无菌检查将灭菌的培养基放入37 温箱中培养24 48h 无菌生长即可使用 或贮存于冰箱或清洁的橱内 备用 2020 4 6 56 四 选择与获取表达细胞 大肠杆菌培养 采用划痕接种法 用接种环从菌种中沾取少量菌液 划线 37摄氏度 恒温培养48到72小时 因为接种时和具体培养条件的不同 其生长一般都在2天外才能长出明显的菌落 菌落特征 乳白色 圆形 菌落边缘整齐 表面光滑 表面和背面颜色一致 2020 4 6 57 五 重组DNA导入表达细胞 氯化钙转化法对数生长期的大肠杆菌经冰浴的氯化钙低渗溶液处理 其细胞膜通透性增加 成为感受态细胞 感受态是指受体细胞处于容易吸收外源DNA的一种生理状态 加入重组质粒 重组质粒与钙离子形成复合物并粘附于细菌细胞膜表面 经42 热休克处理 细胞膜通透性增加 重组质粒DNA进入感受态细胞 导入重组体 细菌在不含抗生素的培养基中培养一定时间 使含有重组质粒的细胞复原并表达抗生素抗性基因 涂布于含有抗生素的培养板上 生长得到转化子 2020 4 6 58 氯化钙法转化的原理机制 在0 的CaCl2低渗溶液中 细菌细胞发生膨胀 Ca2 使细胞膜磷脂层形成液晶结构 促使细胞外膜与内膜间隙中部分核酸酶解离 诱导形成感受态 此外 Ca2 能与加入的DNA分子结合 形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基 磷酸钙复合物 黏附在胞膜的外表面 42 热激处理 细胞膜的液晶结构发生扰动 出现间隙 五 重组DNA导入表达细胞 2020 4 6 59 氯化钙转化法要点 1 氯化钙 二价钙离子 的作用 提高细胞壁 膜 的通透性 2 热激后迅速转移到冰上 促使质粒DNA转移进入胞内 3 这种转化方法适用于双链环状DNA 质粒 线型DNA不能采用此法 在自然界自然发生的转化过程中 进入细菌细胞中的为单链DNA 五 重组DNA导入表达细胞 2020 4 6 60 标准质粒DNA 重组质粒DNA 大肠杆菌JM109 离心机 0 1mol LCaCl2 LB培养基 微量移液器 微量离心管 抗生素 20mmol LMgSO4 微孔滤膜及滤器 培养皿 三角瓶 恒温水浴箱 恒温摇床 超净工作台 玻璃涂布棒 95 乙醇 实验材料 五 重组DNA导入表达细胞 2020 4 6 61 注意事项 质粒的质量和浓度 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋DNA 转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比 但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时 转化效率就会降低 试剂的质量 所用试剂均需要最高纯度的 并用超纯水新鲜配制 灭菌备用 防止杂菌和杂DNA的污染 五 重组DNA导入表达细胞 2020 4 6 62 二价钙离子对转化效率的影响 热激温度对转化效率的影响 五 重组DNA导入表达细胞 2020 4 6 63 感受态细胞的制备 1 从新活化的E coliDH5 平板上挑取一单菌落 接种于3 5mlLB液体培养中 37 振荡培养至对数生长期 12h左右 2 将该菌悬液以1 100 1 50转接于100mlLB液体培养基中 37 振荡扩大培养 当培养液开始出现混浊后 每隔20 30min测一次OD600 至OD600为0 3 0 5时停止培养 并转装到1 5mL离心管中 3 培养物于冰上放置20min 4 0 4 4000g离心10min 弃去上清液 加入1mL冰冷的0 1mo1 LCaCl2溶液 小心悬浮细胞 冰浴20分钟 五 重组DNA导入表达细胞 2020 4 6 64 5 0 4 4000g离心10min 倒净上清培养液 再用1 0mL冰冷的0 1mo1 LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞 冰浴20min 6 0 4 4000g离心10min 弃去上清液 加入100 L冰冷的0 1mo1 LCaCl2溶液 小心悬浮细胞 冰上放置片刻后 即制成了感受态细胞悬液 制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验 如果在4 放置12 24h 其转化效率可以增高4 6倍 也可加入占总体积15 左右高压灭菌过的甘油 混匀后分装于1 5ml离心管中 置于 70 条件下 可保存半年至一年 五 重组DNA导入表达细胞 2020 4 6 65 六 重组体细胞的筛选纯化鉴定 在重组DNA导入受体细胞的实验中 由于重组率很低 因此需要从这些细胞中筛选出期望重组子 将转化后的细胞涂布于特定的固体培养板 生长出的单菌落或噬菌斑进一步筛选和鉴定 2020 4 6 66 1 载体遗传标记法 抗生素抗性筛选法 营养缺陷型筛选法 噬菌斑筛选法 互补筛选法 2 核酸分子杂交法菌落原位杂交 制备与目的基因某一区域同源的探针序列 根据核酸杂交原理 探针序列特异性的杂交目的基因 并通过放射性同位素或荧光基团进行定位检测 六 重组体细胞的筛选纯化鉴定 2020 4 6 67 3 目的基因表达产物测定法如果重组DNA的目的基因能在宿主细胞中编码蛋白质 且宿主细胞本身不含该蛋白质 那么可以通过检测蛋白质的生物功能或结构来筛选和鉴定重组子 六 重组体细胞的筛选纯化鉴定 2020 4 6 68 用荧光原位标记筛选重组体1 制备核酸探针 通过数据库查询所需的寡核苷酸探针的资料 用 合成仪合成 然后用荧光素进行标记 将样品进行打碎 离心 清洗等步骤 使微生物细胞与杂质进行分离 同时增大细胞壁的通透性 保证探针算例进入与 杂交 配置杂交液 其中杂交液中的甲酰胺的浓度直接影响杂交的特异性 将杂交液与样品之一杂交炉 避光 密封 杂交完成后用洗脱液 或 将多余的探针除去 加少量的苯二胺 甘油溶液覆盖样品 防止荧光淬灭 再封片 用荧光显微镜观察 照相进行分析 六 重组体细胞的筛选纯化鉴定 2020 4 6 69 荧光原位杂交技术 荧光原位杂交是一种非放射性原位杂交方法 将荧光标记的探针与待测序列进行杂交 根据杂交信号的有无及类型达到诊断的目的 原理 基于碱基互补配对的原则 用荧光素标记的已知外源DNA或RNA作探针 与载玻片上的组织切片等杂交 与待测核酸的靶序列专一性结合 通过检测杂交位点荧光来显示特定核苷酸序列的存在 数目和定位 六 重组体细胞的筛选纯化鉴定 2020 4 6 70 产物 1 菌种RRhPIZpQE 40E coliM15菌株 七 工程菌产物鉴定和保存 2020 4 6 71 2 材料与试剂DEAE SepharoseFF 琼脂糖快流速阴离子交换剂 为杭州争光树脂有限公司产品 SephadexG 25为Sigma公司产品 Superdex75为GE公司产品 溶菌酶 脱氧核糖核酸酶 胰蛋白酶和羧肽酶B均为Sigma公司产品 谷胱甘肽 氧化型 GSSG 和还原型 GSH 为上海博奥生物科技有限公司产品 二硫苏糖醇 DTY 为OrganicsInc产品 13 巯基乙醇和异丙基 13 D 巯基吡喃半乳糖苷 IPTG 为BB1分装 胰蛋白胨 酵母粉 英国Oxiod公司 氨苄青霉素 美国Sigma公司 其余试剂均为国产分析纯产品 七 工程菌产物鉴定和保存 2020 4 6 72 培养基 LB培养基 g L 胰蛋白胨10 0 酵母提取物5 0 NaCl10 0 pH7 0 发酵培养基 g L 葡萄糖4 甘油15 酵母粉30 蛋白胨30 Na2HPO412 KH2PO46 NH4Cl1 NaCl2 MgSO40 48 pH7 0 甘油补料培养基 g L 甘油300 酵母汁150 MgSO410 pH7 0 所有培养基使用前均加入氨苄青霉素至终浓度50mg L 水平恒温摇床 德国Therma公司 BiostatB发酵系统 德国Braun公司 蛋白质电泳凝胶自动成像系统 英国Syngene公司 七 工程菌产物鉴定和保存 2020 4 6 73 3 细菌培养和RRhPI的表达采用二级发酵的方式 用正交法优化培养条件 并将优化条件用于发酵罐进行发酵 收获湿菌体 RRhPIZpQE 40E coliM15的发酵罐培养 将lOlId经过活化的RRhPI pQE 40E coliM15转移至100ml培养基中进行培养 培养一段时间后 将其转移至含有1 5L培养基的发酵罐中 培养一段时间 转速为300r min 通气量为1 1 5 1 1 8 过程中加人一定量新鲜的培养基并用NaOH调节pH 之后加入IPTG并升温诱导RRhPI的表达 转速随即调为400 500r min 增大通气量至1 1 8 1 2 0 继续培养一段时间后 收集菌体 七 工程菌产物鉴定和保存 2020 4 6 74 4 包涵体的收集和洗涤将收集的湿菌体冻存于 2O 然后悬浮于缓冲液A 50mmol Lrifs HC1 0 5mmol LEDTA 50mmol LNaC1 5 甘油 0 1 0 5mmol LDTY pH7 9 5 6ml g湿菌 中 加入溶菌酶 5mg g湿菌体 室温或37 振荡2h 冰浴超声10S 30次 其间每次间隔20S 功率为200W 10 条件下1000g离心5min去除细胞碎片 上清液中的包涵体 Inclusionbody IB 在4 条件下27000g离心15min收集 然后用含2mol L尿素的缓冲液A充分悬浮 室温静置30min后4 条件下17000g离心15min 收集沉淀 沉淀再用含2 脱氧胆酸钠的缓冲液A充分悬浮 4 条件下17000g离心l5min 收集沉淀 最后沉淀用10mmol Lrifs HC1 pH7 3洗涤两次 4 17000g离心15min 七 工程菌产物鉴定和保存 2020 4 6 75 注意事项 细胞内表达的最大问题就是容易形成不溶性的包涵体 它的形成对表达产物的活性不利 七 工程菌产物鉴定和保存 2020 4 6 76 包涵体 inclusionbody 是细菌表达的蛋白质在胞内互相凝集而形成的无活性固体颗粒 具有很强的折光性 正常的大肠杆菌基因以重组方法使其在大肠杆菌内表达也会形成包涵体 说明不仅仅是外源蛋白才能形成包涵体 同时也发现有表达量较低的基因产物也是以不可溶形式存在的 包涵体的形成不仅仅与宿主细胞 表达基因有关 还与培养外环境有关系 其形成的原因多数认为 目的基因的过度表达使蛋白质无足够时间进行肽链折叠 产生凝集 重组蛋白所处的环境条件对包涵体也有较大影响 如当温度超过某一种蛋白质的变性温度时 随着温度的增加凝集量也增加 当环境PH接近某一种蛋白的等电点时 蛋白的凝集增加 包涵体的形成也增多 此外 离子组成和强度 辅助因子 氧化还原电位等均可影响包涵体的形成 七 工程菌产物鉴定和保存 2020 4 6 77 应对方案 改变发酵条件 如发酵温度 培养的PH值等来减少重组蛋白的凝集 进而有效控制包涵体的形成 给下游纯化工作创造有利条件 七 工程菌产物鉴定和保存 2020 4 6 78 5 RRhPI的初步纯化将收集的IB用含有0 1 0 3 13 巯基乙醇的缓冲液B 30mmol LHC1 8mol L尿素 pH8 0 溶解 上于已用缓冲液B平衡的DEAE SepharoseFF柱 用合适的氯化钠梯度洗脱 收集含RRhPI的洗脱液 6 RRhPI的重组复性将初步纯化后的RRhPI通过SephadexG 25脱尿素 转换缓冲液为不同pH的50mmol LGly NaOH重组液 或含有适量GSSG的Gly NaOH缓冲液中 使蛋白终浓度为0 1 0 6mg mL 收集趋于正确折叠的RRhPI单体组分 加人适量GSH和GSSG 4 放置24h 七 工程菌产物鉴定和保存 2020 4 6 79 7 酶切转化向RRhPI复性液中加入一定量的胰蛋白酶和羧肽酶B 37 酶切一段时间 然后用0 1mol LZnC1终止反应并沉淀生成的hI 8 hI的纯化将hI粗品用30mmol LTris2HCl 8mol L尿素 pH8 0溶解 在Superdex75上进行分离纯化 七 工程菌产物鉴定和保存 2020 4 6 80 分离纯化 层析柱的平衡液和洗脱液均为0 2mol L乙酸钠二乙酸 pH4 0用0 1mol LZnCl2沉淀的hI粗产品可通过Superdex75进行纯层析图谱见图1 hI主要集中在峰3 收集峰3进行SDS2PAGE分析 结果显示 见图2 所得hI组份在SDS2PAGE分析中是均一的 只有一条蛋白带 将峰3组分透析 浓缩并冻干 即可最终制得hI 图1 Superdex75纯化hI 图2十二烷基磺酸钠 聚丙稀酰胺凝胶电泳 SDS PAGE 七 工程菌产物鉴定和保存 2020 4 6 81 产物进一步鉴定 1 氨基酸组成测定取纯化的胰岛素 经5 7mol L盐酸水解 用氨基酸自动分析仪测定氨基酸组成 2 与人胎盘细胞膜胰岛素受体结合 3 胰岛素的生物活力测定体内活力用半定量小白鼠惊厥方法测定 七 工程菌产物鉴定和保存 2020 4 6 82 常见的保藏方法有以下几种 1 短期保存可以用琼脂穿刺进行 2 长期保存大多采取低温保存 用LB培养基培养过夜 离心后加一定的菌种保藏液 含甘油 在 20 下保藏 3 用液氮迅速冷却 减压升华去除水之后在 80 下保存 七 工程菌产物鉴定和保存 2020 4 6 83 八 发酵培养 发酵培养流程的设计 2020 4 6 84 八 发酵培养 发酵培养流程的设计 2020 4 6 85 生产工艺流程功能间分布 八 发酵培养 2020 4 6 86 八 发酵培养 生产工艺流程功能间分布 2020 4 6 87 八 发酵培养 摇瓶发酵试验摇瓶培养水平下 用优化的发酵培养基和比浊法测RRhPI pQE40E coliM15的生长曲线 2020 4 6 88 八 发酵培养 摇瓶发酵试验用接种环挑取斜面保存的RRhPI pQE40E coliM15一环接种于3mlLB AK培养基中 37 220r min 1恒温振荡培养一段时间 取100 l菌液接种于5mlLB AK培养基中 37 220r min 1恒温振荡培养一段时间即可 活化的种子可在4 下保存数周待用 2020 4 6 89 八 发酵培养 摇瓶发酵试验将5ml活化种子转接到50ml优化后的发酵培养基中 恒温振荡培养一段时间 取50ml经一级发酵扩培后的菌液转接到500ml发酵培养基中 恒温振荡培养一段时间后加入IPTG诱导人胰岛素原的表达 继续恒温振荡培养一段时间后结束发酵 3 103r min 1离心15min 沉淀即得RRh2PI pQE40E coliM15湿菌体 于 20 保存 2020 4 6 90 八 发酵培养 摇瓶发酵试验采用正交法 结合摇瓶发酵工艺的前期研究 选取摇瓶培养条件中7个主要因素进行两水平正交优化 7个因素为种子活化方式 摇床转速 通风量 IPTG诱导温度 接种量 IPTG添加量 诱导时间和补料方式 以每升培养基收获湿菌体的量及发酵液的A600为目标量考察条件优化的效果 2020 4 6 91 八 发酵培养 摇瓶发酵试验进行8次实验 对实验结果进行分析 优化出最佳实验条件 并做3次水平重复试验 分别测定每升培养基收获湿菌体的量 发酵液的A600及每升培养基收获包涵体的量 IPTG诱导基因工程大肠杆菌表达RRhPI 对诱导时间的影响进一步做了分析 基因工程菌在三角摇瓶培养至对数生长中期 加入0 5mmol L 1IPTG进行诱导 每隔1h取样 以SDS PAGE分析RRhPI的表达情况 2020 4 6 92 八 发酵培养 摇瓶发酵结果在摇瓶培养水平下 采用优化的发酵培养基发酵RRhPI pQE40E coliM15 培养4h后即进入对数生长期 而且对数生长期可延至17h 2020 4 6 93 八 发酵培养 摇瓶发酵结果采用优化出的最佳实验条件做3次平行验证试验 结果见表 2020 4 6 94 八 发酵培养 摇瓶发酵结果综合每升培养基所收获湿菌体的量 wetweight g L 1 和发酵液的A600两个指标 选取关键因素的最优条件 结果表明摇床转速 即通风量 与补料方式对发酵结果影响最大 IPTG的诱导时间和添加量次之 2020 4 6 95 八 发酵培养 摇瓶发酵结果正交试验所得菌体经溶菌酶或 声破碎细胞后得到的包涵体SDS PAGE的结果见图 2020 4 6 96 八 发酵培养 摇瓶发酵结果RRhPI pQE40E coliM15表达的外源蛋白 His 6 Arg Arg 人胰岛素原以包涵体形式存在 其分子大小约为13kD 由图可知 在哪种正交实验条件下包涵体的表达量较高 2020 4 6 97 八 发酵培养 摇瓶发酵结果RRhPI pQE40E coliM15在摇瓶中培养至对数生长中期 加入0 5mmol L 1IPTG进行诱导 每隔1h取样 以SDS PAGE分析RRhPI的表达情况 如图 2020 4 6 98 八 发酵培养 摇瓶发酵结果结果RRhPI pQE40E coliM15在IPTG诱导4 5h时 富含包涵体的湿菌体 约24kD 收率较高 相应的目的蛋白表达量较高 继续诱导并未使湿菌体表达量有所提高 因此 诱导3 5 4h既有利于富含包涵体的湿菌体及目的蛋白的表达 又可缩短发酵时间 简化生产工艺 2020 4 6 99 八 发酵培养 细胞的两种破碎方法其一是溶菌酶 超声破碎细胞 发酵所得RRhPI pQE40E coliM15湿菌体 悬浮于适量缓冲液A 50mmol L 1Tris HCl 0 5mmol L 1EDTA 50mmol L 1NaCl 5 甘油 0 1 0 5mmol L 1DTT pH7 90 中 加入溶菌酶 5mg g 1湿菌体 室温或37 振荡2h 在冰浴中超声 10s 30 每次间隔20s 功率200W 2020 4 6 100 八 发酵培养 细胞的两种破碎方法其二是超声破碎细胞 大肠杆菌湿菌体悬浮于适量的缓冲液A中 充分溶解 冰浴超声 40s 10 每次间隔30s 功率200W 2020 4 6 101 八 发酵培养 细胞的两种破碎方法两种破碎方法所得包涵体洗涤后作SDS PAGE 洗涤时均先后用含2mol L 1尿素的缓冲液和含2 脱氧胆酸钠 DOC 的缓冲液各洗涤1次 最后用10mmol L 1Tris HCl清洗两次 2020 4 6 102 八 发酵培养 包涵体的三种洗涤方法溶菌酶 超声破碎细胞的裂解液于4 114 104r min 1离心15min 收集沉淀 洗涤方法一是将此沉淀用2mol L 1尿素的缓冲液充分溶解 离心收集沉淀 沉淀再用2 DOC的缓冲液洗涤 离心 所得沉淀用10mmol L 1Tris HCl清洗2次 即得包涵体 于 20 保存 2020 4 6 103 八 发酵培养 包涵体的三种洗涤方法方法二则用缓冲液充分洗涤沉淀两次 收集沉淀保存 方法三用2 DOC的缓冲液洗涤1次 再用10mmol L 1Tris HCl清洗两次 离心收集沉淀保存 取上述不同方法洗涤的沉淀 用SDS PAGE检测洗涤效果 2020 4 6 104 八 发酵培养 结果说明 1 2 3 项中破碎方法一较好 即用溶菌酶和超声破碎结合可彻底破碎细胞 并使表达产物包涵体充分溶出 1 2 4 项中方法一的洗涤效果优于方法二和三 即采用变性剂2mol L 1尿素及离子型去污剂2 DOC洗涤的效果较好 2020 4 6 105 菌种活化与扩大培养将冻存的工程菌复苏后接种于LB平板培养基 37 培养24h 挑取单菌落接种于5mLLB液体培养基 37 250r min振荡12h后 按1 100比例转种于LB液体培养基中 继续振荡10h作为发酵种子液 八 发酵培养 发酵步骤 2020 4 6 106 八 发酵培养 发酵罐发酵发酵罐的选取培养设备以及设备控制应满足获得高浓度的受体细胞和高表达的基因表达产物 发酵罐的组成部分 发酵罐体 保证高传质作用的搅拌器 精细的温度控制和灭菌系统 空气无菌过滤装置 残留气体处理装置 参数测量与控制系统 如pH O2 CO2等 培养液配制及连续操作装置等 发酵步骤 2020 4 6 107 八 发酵培养 发酵罐发酵 发酵步骤 2020 4 6 108 发酵罐发酵采用自控5L发酵罐进行分批补料发酵试验 初始工作体积为3 0L 设置指标为 发酵温度37 初始搅拌速度400r min 初始通气量1 5L min 不断提高搅拌转速与通气量最大分别至650r min和3 5L min以维持溶解氧始终在30 以上 pH值诱导前为7 2 诱导后为7 4 培养分分批培养和分批补料两个阶段 每隔1h取样测定A650nm 细胞干重和葡萄糖浓度等参数 当检测到培养基中葡萄糖耗尽时开始采用pH stat反馈流加的方式补料 即当发酵液的pH达到7 4时设定pH反馈 高于设定的pH即开始补加发酵补料培养基 直至达到设定的pH时停止流加 补料总量为发酵液总体积的20 诱导后培养5 7h 放罐 SDS PAGE检测表达情况 八 发酵培养 发酵步骤 2020 4 6 109 高密度发酵补料控制工艺以甘油作为限制性基质进行分批补料发酵 分别考察不同补料模式对工程菌生长和重组蛋白表达的影响 1 恒速补料法在开始诱导后 分别依照恒定的速度 10 20 30 40mL h 流加甘油补料培养基 通过流加氨水和稀盐酸控制pH值 2 分阶段变速补料法在开始诱导后 以20mL h的初速度流加甘油补料培养基 并以5mL h的增加速度 逐渐提高补料速度 3 恒定pH反馈补料法在发酵的不同阶段设定培养环境的pH 初始培养期以发酵培养基pH7 0为设定