发酵工程与设备第12章、氨基酸发酵

第12章谷氨酸 味精 的发酵生产 1 在医药工业中的应用重要营养剂 复合氨基酸 营养或代谢失调治疗药剂 精氨酸 氨中毒性肝昏迷赖氨酸 利尿辅助药物赖与蛋合用 抑制重症高血压病短肽药物 谷胱甘肽 光谱解毒作用合成药原料 丙氨酸 天门冬氨酸 VB6 氨基酸的应用与功能 1 氨基酸的应用与功能 2 2 在食品工业中的应用营养与食品强化 八种必需氨基酸风味和调味 L 谷氨酸钠 味精 增香与除臭 赖 丙 缬等改良香气抗氧与保质 光 亮 色等 抗氧化剂防腐与保鲜 甘氨酸 赖氨酸 水果保鲜与保色 氨基酸的应用与功能 3 3 在农业中的应用饲料工业 8种 精AA 组AA 其中赖氨酸 蛋氨酸最多 生物农药 杀虫剂 除草剂 杀菌剂 农药稳定剂 脱叶剂 氨基酸的应用与功能 4 4 在日化工业中的应用氨基酸系表面活性剂 酰基谷氨酸高分子合成领域应用 赖氨酸 氨基甲酸乙酯化妆品中的应用 谷胱甘肽和半胱氨酸并存可阻碍黑蛋白色素的形成 氨基酸工业发展史 1820 水解蛋白质制氨基酸 1850 实验室化学法合成氨基酸 1866 德 硫酸水解小麦面筋得GA 1872 酪蛋白制GA 日 海带汁中提GA 1910 日 味之素公司水解法生产GA 1936 美 甜菜废液中提GA 1948 日 发现 酮戊二酸产生菌 1954 日 两博士报告直接发酵GA的研究 1956 日 协和发酵公司分离出GA棒杆菌 理论研究阶段 氨基酸工业发展史 续 1957 日 味之素 三乐 旭化成工业公司相继投产 1958 日 志村 植村提出苏氨酸 异亮氨酸的添加前体发酵法 1959 日 北原通过酶法完成反丁烯二酸生产L 天冬氨酸的发酵 1961 日 协和进行L 高丝氨酸 L 苯丙氨酸 L 酪氨酸的发酵 1962 日 协和进行了大量的石油氨基酸发酵的研究 1965 报道了L 瓜氨酸 L 脯氨酸发酵的研究 1966 日 大规模地转化为以醋酸为原料发酵生产GA 1967 日 三乐公司以乙醇为原料的L 谷氨酸发酵 90年后 甘蔗或甜菜糖蜜为原料 通过添加青霉素发酵法生产GA 工业化研究阶段 国外主要氨基酸生产企业 日本味之素公司 Ajinomoto 日本协和发酵公司 KyowaHakko 德国Degussa公司美国ADM公司 世界 味精 产量 世界 赖氨酸 生产企业 2 国内主要 味精 生产企业 沈阳红梅味精股份有限公司河南莲花味精股份有限公司山东菱花集团公司江苏菊花味精集团有限公司广州奥桑味精食品有限公司杭州丰汇发酵有限公司广州肇庆星湖味精股份有限公司 国内 赖氨酸 生产企业 我国与日本赖氨酸技术比较 国内 氨基酸医药 生产企业 目前 我国药用氨基酸原料生产厂已发展到40多家 产量由1994年的600多t增长4000多t 18种必需氨基酸中已有17种实现了国产化 氨基酸类药物最大的应用领域是氨基酸输液 2000年约消费1亿瓶 2005年达到3亿 5亿瓶 湖北八峰药业股份有限公司 该公司已开展三大氨基酸工程项目 150t aL 色氨酸 500t a蛋氨酸和1 6亿瓶氨基酸口服液 3项目建成后 公司将实现年销售收入10亿元 可使我国氨基酸生产的4大瓶颈问题 色氨酸 组氨酸 丝氨酸 精氨酸 得到缓解 上海Ajinomoto氨基酸有限公司 2000年3月2日在沪建成投产 一期产品为丙氨酸 精氨酸 组氨酸 苏氨酸等10个医药用氨基酸品种 产量为830t a 今后将增加到17个品种 并逐步扩大生产规模 部分产品还将出口美国 欧洲等地 并返销日本 上海已与日本KyowaHakko公司达成协议 引进日本全套先进发酵技术 生产精氨酸 组氨酸 环丝氨酸等国内氨基酸工业的缺口产品 解决了我国氨基酸工业中的瓶颈现象 上海将成为中国最大的药用氨基酸生产基地 氨基酸的生产方法 蛋白质水解法化学合成法微生物发酵法酶法 一 谷氨酸生产菌 1 主要菌株 棒状杆菌属 Corynebacterium 短杆菌属 Brevibacterium 小杆菌属 Microbacterium 节杆菌属 Arthrobacter 国内常用菌株 北京棒杆菌AS1 299 7338 S 941 D110钝齿棒杆菌AS1 542 HU7251 B9天津短杆菌T6 13 FM 8207 U 9 TG 3 TG 866 D85 2 谷氨酸生产菌的主要特征 1 G 无芽孢 无鞭毛 不运动 2 都是需氧型 3 多为生物素缺陷型 4 不分解淀粉 纤维素 油脂 酪蛋白等 5 发酵中菌体发生明显的形态变化 同时发生细胞膜渗透性的变化 6 二氧化碳固定反应酶系活力强 7 异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱 乙醛酸循环弱 8 酮戊二酸氧化能力缺失或微弱 9 柠檬酸合成酶 乌头酸酶 异柠檬酸脱氢酶 谷氨酸脱氢酶活力强 10 具有向环境中泄漏谷氨酸的能力 二 谷氨酸发酵机制 1 生成谷氨酸的主要反应 1 谷氨酸脱氢酶 GHD 催化的还原氨基化反应 GHD 酮戊二酸 NH4 NADPH2 谷氨酸 H2O NADP 2 转氨酶催化的转氨反应 3 谷氨酸合成酶 GS 催化的反应 谷氨酸发酵机制 2 谷氨酸生物合成途径 酵解途径 EMP 己糖一磷酸途径 HMP 三羧酸循环 TCA 乙醛酸循环二氧化碳固定反应 谷氨酸发酵机制 TCA循环 谷氨酸发酵机制 柠檬酸合成酶 顺乌头酸酶 异柠檬酸脱氢酶 酮戊二酸脱氢酶复合体 谷氨酸脱氢酶 由葡萄糖合成谷氨酸的代谢途径 谷氨酸发酵机制 乙醛酸循环TCA循环的一条回补途径柠檬酸裂解酶 苹果酸合酶 CO2固定 由葡萄糖发酵谷氨酸的理想途径 谷氨酸合成的理想途径 谷氨酸发酵机制 谷氨酸积累机理 1 谷氨酸产生菌丧失或仅有微弱的 酮戊二酸脱氢酶活力 使 酮戊二酸不能继续氧化 但谷氨酸脱氢酶活力很强 同时NADPH2再氧化能力弱 这样就使 酮戊二酸到琥珀酸的过程受阻 在有过量铵离子存在时 酮戊二酸经氧化还原共轭的氨基化反应而生成谷氨酸 2 谷氨酸产生菌大多为生物素缺陷型 谷氨酸发酵时通过控制生物素亚适量 引起代谢失调 使谷氨酸得以积累 3 生成的谷氨酸不形成蛋白质 而分泌泄漏于菌体外 4 谷氨酸产生菌不利用菌体外的谷氨酸 而使谷氨酸成为最终产物 谷氨酸发酵机制 但是 当环境条件发生变化时 菌体的生物代谢也会发生变化 谷氨酸发酵会向其他发酵转换 谷氨酸积累减少 而其他副产物积累量增加 例如 谷氨酸发酵机制 3 控制细胞膜的通透性 谷氨酸发酵的关键在于发酵培养期间谷氨酸生产菌细胞膜结构与功能上的特异性变化 使细胞膜转变成有利于谷氨酸向膜外渗透的样式 即完成谷氨酸非积累型细胞向谷氨酸积累型细胞的转变 这样 由于终产物谷氨酸不断地排出细胞外 使细胞内的谷氨酸不能积累到引起反馈调节的浓度 谷氨酸就会在细胞内继续不断地被优先合成 谷氨酸发酵机制 亲水的头部 疏水尾部 控制细胞膜渗透性的方法 控制的关键 亚适量控制生物素 1 化学控制法 通过控制发酵培养基中的化学成分 达到控制磷脂 细胞膜的形成或阻碍细胞壁正常的生物合成 使谷氨酸生产菌处于异常的生理状态 以解除细胞对谷氨酸向胞外漏出的渗透障碍 1 生物素缺陷型 作用机制 生物素作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶 参与了脂肪酸的合成 进而影响磷脂的合成 当磷脂合成减少到正常量的一半左右时 细胞变形 谷氨酸向膜外漏出 积累于发酵液中 谷氨酸发酵机制 2 添加表面活性剂或饱和脂肪酸 化学控制法 使用生物素过量的糖蜜原料发酵生产谷氨酸时 通过添加表面活性剂 如吐温60 或是高级饱和脂肪酸及其亲水聚醇酯类 同样能清除渗透障碍物 积累谷氨酸 作用机制 在不饱和脂肪酸合成过程中作为抗代谢物对生物素有拮抗作用 通过拮抗脂肪酸的生物合成 导致磷脂合成不足 结果形成磷脂不足的细胞膜 提高细胞膜对谷氨酸的渗透性 关键 必须控制好添加表面活性剂 饱和脂肪酸的时间与浓度 化学控制法 3 油酸缺陷型 作用机制 油酸缺陷型菌株丧失了自身合成油酸的能力 也即丧失脂肪酸合成能力 必须由外界供给油酸才能生长 油酸含量的多少直接影响到磷脂合成量的多少和细胞膜的渗透性 通过控制油酸 使磷脂合成量减少到正常量的一半左右时 细胞变形 谷氨酸分泌积累于发酵液 控制的关键 必须控制油酸的亚适量 细胞内生物素含量的多少影响甚微 4 甘油缺陷型 化学控制法 作用机制 甘油缺陷型不能合成 磷酸甘油和磷脂 必须由外界供给甘油才能生长 在甘油限量供应下 由于控制了细胞膜中与渗透性有直接关系的磷脂含量 使谷氨酸得以积累 控制的关键 必须控制添加亚适量的甘油或甘油衍生物 以上都是通过控制磷脂的合成 导致形成磷脂合成不足的不完全的细胞膜 5 添加青霉素法 作用机制 在发酵对数生长期的早期添加青霉素抑制细胞壁的合成 使细胞膜处于无保护状态 又由于膜内外的渗透压差 进而导致细胞膜的物理损伤 增大了谷氨酸向胞外漏出的渗透性 化学控制法 关键 在生长的什么阶段添加青霉素是影响产酸的关键 必须在增殖过程的适当时期添加 且必须在添加后再进行一定的增殖 2 物理控制法 如利用温度敏感突变型 Ts 关键 在生长的什么阶段转换温度是影响产酸的关键 突变发生在决定与谷氨酸分泌有密切关系的细胞膜结构基因上 二 生产工艺 淀粉水解糖的制备谷氨酸发酵谷氨酸提取谷氨酸制味精 一 淀粉水解糖的制备 目前的谷氨酸产生菌都不能直接利用淀粉 也基本上不能利用糊精 因此必须将淀粉水解成葡萄糖 水解糖制备的方法 1 酸解法 以无机酸为催化剂 高温高压 2 酸酶法 先将淀粉水解成糊精或低聚糖 再用糖化酶水解为萄糖 3 酶酸法 将淀粉乳先用 淀粉酶液化 再用酸水解成葡萄糖 4 双酶法 用淀粉酶和糖化酶结合将淀粉水解成葡萄糖 1 酸解法 以酸 无机酸或有机酸 为催化剂 在高温高压下将淀粉水解转化为葡萄糖的方法 优点 生产简易 由淀粉逐步水解为葡萄糖的整个化学反应过程 仅在一个高压容器内进行 水解时间短 设备生产能力大 如采用10 Be 浓度淀粉 在0 294Mpa压力下需20min 在0 343Mpa压力下仅需7 10min 缺点 1 由于水解作用是在高温高压条件下进行的 要求设备耐腐蚀 耐高温 高压 2 在酸水解过程中 除了淀粉的水解反应外 尚有副反应的发生 将造成淀粉的利用率降低 3 酸水解法对淀粉原料要求严格 淀粉浓度不宜过高 2 酶解法 双酶水解法 酶解法是用淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖 酶解法可分两步 第一步 利用 淀粉酶将淀粉转化为糊精和低聚糖 使淀粉的可溶性增加 此过程称 液化 第二步 利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解 转变为葡萄糖 此过程称 糖化 液化 和 糖化 都是在酶作用下完成的 故得名 1 淀粉水解是在酶的作用下进行的 酶解反应条件温和 对设备要求较低 双酶法优点 如采用BF7658菌的 淀粉酶 反应温度在85 90 C pH6 0 7 0 用糖化酶 反应温度50 60 C pH3 5 5 0 2 微生物酶作用的专一性强 淀粉的水解副反应少 因而水解糖液纯度高 淀粉的转化率 出糖率 高 3 可在较高淀粉乳浓度下水解 且可采用粗原料 酸解法一般10 12 Be 含淀粉18 20 双酶法一般20 23 Be 含淀粉34 40 4 酶法制得的糖液色浅 较纯净 无苦味 质量高 双酶法缺点 酶解反应时间较长 需2 3天 要求的设备较多 需具备专门培养酶的条件 由于酶本身是蛋白质 易造成糖液过滤困难 3 酸酶结合法 1 酸酶法 酸解 酶解 有些淀粉 如玉米 小麦等谷类淀粉 淀粉颗粒坚实 如用 淀粉酶液化 在短时间内 液化反应往往不彻底 可采用酸将淀粉水解至葡萄糖值10 15 然后将水解液降温 中和 加入糖化酶进行糖化 葡萄糖值 DE值 dextroseequivalentvalue 指葡萄糖 所有测定的还原糖都当作葡萄糖 占干物质的百分率 用于表示淀粉水解程度及糖化程度 酸酶法特点 液化速度快 糖化是由酶来进行的 对液化液要求不高 可采用较高的淀粉乳浓度 提高生产效率 用酸较少 产品颜色浅 糖液质量较高 2 酶酸法 有些淀粉原料颗粒大小不一 如碎米淀粉 如果用酸法水解 常致使水解不均匀 出糖率低 可先采用 淀粉酶液化 过滤除杂后 再用酸法水解制葡萄糖 酶酸法特点 可采用粗原料淀粉 淀粉浓度也较酸法高 糖液色浅 不同工艺所得糖化液质量比较 双酶法糖化程度最高 水解液的葡萄糖含量最高 淀粉的出糖率较高 原料单耗较少 糖液杂质 灰分 羟甲基糠醛 色素 最少 从水解糖的质量及降低糖耗 提高原料利用率方面来考虑 则以双酶法最好 酸酶法次之 酸法最差 从时间来说 则酸法最短 双酶法最长 淀粉酸水解理论基础 水解反应 复合反应 分解反应 淀粉的水解反应 直链淀粉100 60000 1 4糖苷键 1 4糖苷键 1 6糖苷键 支链淀粉1000 3000000 普通谷物和薯类淀粉含直链淀粉17 27 其余为支链淀粉 粘玉米 糯米全部为支链淀粉 酸解中淀粉糖苷键断裂过程 酸催化剂的氢离子先与水分子结合生成H3O H3O 能与糖苷键的氧原子结合生成不稳定化合物 称共轭酸 随后C1 O键断裂生成C1正碳离子 II 水分子与具有正电荷的C1结合 再使C1失去H 完成糖苷键的水解过程 淀粉分子糖苷键的断裂是逐步进行的 随着糖苷键的断开 其相对分子质量逐渐变小 先变为糊精 低聚糖 麦芽糖 最后生成葡萄糖 淀粉水解程度的增加 糖化液的还原性不断增加 这是由于生成的葡萄糖 麦芽糖及低聚糖等具有还原性基团 当葡萄糖值超过60以上 由于葡萄糖的复合分解反应 产生其他有味物质 如龙胆二糖有苦味 及色泽加深 葡萄糖的复合反应 在淀粉的酸糖化过程中 水解生成的葡萄糖受酸和热的催化影响能通过糖苷键相聚合 失掉水分子 生成二糖 三糖和其他较高的低聚糖等 这种反应称为复合反应 两个葡萄糖分子通过复合反应相聚合 并不是再经过 1 4糖苷键聚合成麦芽糖 而是主要经 1 6糖苷键聚合成异麦芽糖和经 1 6键聚合成龙胆二糖 葡萄糖 葡萄糖 影响复合反应的因素 1 淀粉浓度 糖浓度 葡萄糖浓度与复合反应关系很大 低浓度葡萄糖不发生复合反应 浓度愈高 复合反应进行程度愈大 但淀粉乳浓度过低 生成葡萄糖也低 设备生产能力就低 2 酸的种类和浓度 不同种类的酸对于葡萄糖复合反应催化作用不同盐酸最强 其次是硫酸 草酸 随着酸浓度的增加 复合糖量增加 3 温度 通常而言 反应温度越高 复合反应越强 水解液中多数复合糖不能被微生物利用 这些复合糖的存在将使发酵的残糖增加 增加产物提取精制的困难 葡萄糖的分解反应 葡萄糖受酸和热的影响发生分解反应 生成5 羟甲基糠醛 5 羟甲基糠醛性质不稳定 又进一步分解成乙酰丙酸 蚁酸和有色物质等 这些分解物又能聚合成其他物质 反应是很复杂的 在淀粉的酸糖化过程中 葡萄糖因分解反应而损失的量并不多 约1 但所生成的5 羟甲基糠醛是产生色素的前体 有色物质的存在将增加糖化液精制的困难 葡萄糖的分解反应与浓度 温度 酸度有关 以大米为原料的酶酸法制糖工艺 清洗 常温 以手捏碎为佳 1 5h 15波美度左右 0 3 CaCl2 pH6 3 6 5 保护淀粉酶活力 加酶 淀粉酶 0 25 0 3 90 间隙通空气 10 20min 碘液反应检查 100 105 5min pH1 8 糖化 0 28MPa 10 15min 无白色反应 无水酒精检查 调pH4 0 4 8 蛋白析出 活性碳吸附法 0 1 0 4 70 二 谷氨酸发酵 1 菌种的扩大培养 普遍采用二级发酵 一级种子罐 斜面菌种 30 32 18 24小时 摇瓶种子 目的在于大量繁殖活力强的菌体 培养基组成以少含糖分 多含有机氮为主 种子罐培养接种量 0 8 1 0 温度 32 时间 7 8小时通风量 50L 1 0 5250L 1 0 3500L 1 0 25 2 发酵控制 1 培养基 碳源 多用淀粉水解糖 在一定范围内 谷氨酸的产量随糖浓度增加而增加 但过高 由于渗透压增大 对菌体生长和发酵均不利 目前国内常用125 150g L 产酸55 70g L 有的采用高糖工艺 170 190g L 产酸80g L 但周期延长 淀粉水解糖质量对谷氨酸发酵的影响很大 如果淀粉水解不完全 有糊精存在 不仅造成浪费 还会产生过多泡沫 影响发酵的正常进行 若淀粉水解过分 葡萄糖发生复合反应生成龙胆二糖 异麦芽糖等非发酵性糖 同时葡萄糖发生分解反应 生成5 羟甲基糠醛 并进一步分解生成有机酸和黑色素等物质 对菌体生长和谷氨酸发酵均有抑制作用 发酵控制 氮源 尿素 玉米浆 麸皮水解液 液氨 碳酸氢铵 30 80 的氮用于合成谷氨酸 发酵控制 C N C N 100 15 30 比一般高 100 0 2 2 0 在发酵的不同阶段控制不同的C N在长菌阶段 如NH4 过量会抑制菌体生长 在产酸阶段 如NH4 不足 谷氨酸的积累减少 发酵控制 生长因子 目前以糖质原料为碳源的谷氨酸产生菌均为生物素缺陷型 以生物素为生长因子 生物素的作用主要是影响谷氨酸产生菌细胞膜对谷氨酸的通透性 用量 菌体生长所需的 亚适量 一般5 g L 生物素过量 不产或少产谷氨酸 生物素不足 菌体生长不好 谷氨酸产量也低 发酵控制 提供生长因子的农副产品原料 玉米浆 麸皮水解液 糖蜜 酵母 发酵控制 2 温度 最适生长温度30 34 谷氨酸产生的最适温度35 37 可采用变温控制 发酵控制 3 pH 发酵前期控制在7 5左右发酵中期7 2发酵后期7 0临近放罐时6 5 6 8 发酵控制 调节pH方法 尿素流加法国内厂家多采用 液氨或氨水添加法液氨含氨量99 99 8 氨水含氨量20 25 国外多采用该法 发酵控制 4 供氧 在菌体生长期供氧必须满足菌体呼吸的需氧量 谷氨酸生成期应充分供氧 在细胞最大呼吸速率时 谷氨酸产量大 发酵控制 三 谷氨酸提取 等电点法离子交换法金属盐法盐酸水解 等电点法离子交换膜电透析法 国内多采用等电点 锌盐法该法收率可达85 90 等电点 锌盐法工艺简介 1 先采用等电点法提取谷氨酸 回收70 左右 1 原理 pH pI时谷氨酸的溶解度最小 谷氨酸的等电点pI pK1 pK2 2 2 19 4 25 2 3 22 将发酵液调至pH 3 2 使谷氨酸处于过饱和状态而结晶析出 2 谷氨酸的晶型及性质 在不同条件下会形成两种不同的晶体 型晶体 斜方六面体 纯度高 颗粒大 质量好 与母液分离容易 为理想的晶型 型晶体 粉状或针状 鳞片状 晶体微细 纯度低 晶体无光泽 质量轻 难沉淀 生产上应避免形成该类晶体 3 影响谷氨酸结晶的主要因素 A 温度与降温速度 当结晶析出温度超过30 型晶体明显增加 因此须把发酵液的温度降到30 以下 再进行晶体析出 中和时要控制液温缓慢下降 不能回升 降温过快或忽高忽低 则晶核小而多 结晶微细 且会引起 型向 型转变 B 加酸速度与终pH的影响 若加酸速度太快 会局部过饱和 出现大量细小晶核 形成 型晶体 开始加酸至pH5左右 加酸可快些 pH5以下 起晶前后 加酸速度要慢 须小心 发现晶核时 应立即停止加酸 育晶2h 使晶核成长 然后再继续缓慢加酸中和至pH3 2 C 投晶种 起晶有两法 加晶种起晶 晶核容易控制 不易出现 型晶体 但必须注意晶种的质量 选择较好的 型晶体 并应掌握好投晶种的时机 D 搅拌的影响 搅拌有利于