角化细胞培养研究进展

角化细胞 KC 培养研究进展 提纲 KC来源及分化过程KC的作用KC培养方法滋养层细胞培养无滋养层细胞培养影响KC培养的的因素霍乱毒素 CT 表皮生长因子 EGF 和钙离子 Ca2 一 KC来源及分化过程 KC来源及分化过程 皮肤主要由表皮和真皮组成 中间由基底膜隔开 表皮由上至下分别为角质层 颗粒层 棘层和基底层 KC主要来源于基底层 1 皮肤结构和KC来源 KC来源及分化过程 表皮干细胞 定向祖细胞 终末分化KC 凋亡KC 10 14d 干细胞含量较少 通常处于静息状态 分裂缓慢 短时间获取大量干细胞难度大 而定向祖细胞具有分化潜能且分裂较快的优点 桥粒和角化包膜形成 2 KC分化过程 二 KC的作用 KC的抗菌作用 1 KC通过PRR识别病原体 Kollisch等 2005 用RT PCR方法发现KC可表达不同的TLR亚型 PGN poly I C 和flagelli可分别与KC的TLR2 TLR3和TLR5结合 从不同程度刺激KC分泌IL 8 说明KC可通过TLR识别细菌上的病原相关分子模式 PAMP 分泌IL 8等物质清除病原体 KC的抗菌作用 2 KC分泌AMP杀灭病原体 Glaser等 2005 用抗菌测试试验发现抗菌肽S100A7可特异性的杀死大肠杆菌 ONG等 2005 研究发现LL 37能有效杀灭葡萄球菌 KC在抵抗外来微生物入侵中的另一个重要作用是产生大量的AMP 阳离子抗菌肽主要有LL 37 防御素和S100蛋白家族 HarderandSchroder 2005 三 KC的培养方法 KC培养最早始于1967年 Briggaman等 1967 随后人们陆续培养出鼠 Marvin等 1971 兔 Liu等 1978 和狗 Wilkinson等 1987 等的KC 使用的培养方法包括滋养层培养法和无滋养层培养法 滋养层细胞培养 1 以3T3细胞作为滋养层 1975年 Rheinwald等首次成功地在体外连续培养人正常KC 他们把射线灭活的鼠3T3细胞作为滋养层 将胰蛋白酶消化后的单个KC接种于其上 发现KC能明显抑制3T3细胞 且自身生长良好 并将3T3滋养层细胞不断推至培养皿边缘 图中红色为KC 蓝色为3T3细胞 滋养层细胞培养 1 以3T3细胞作为滋养层 Alain等 1986 用3T3滋养层培养法成功培养了人头皮毛囊KC 5d 18d 滋养层细胞培养 2 以成纤维细胞作为滋养层 Alain等 1989 首先介绍了用自体成纤维细胞代替3T3细胞作为滋养层 成功培养了人头皮毛囊KC 真皮成纤维细胞 丝裂霉素C 或射线 有丝分裂后细胞 成纤维细胞滋养层 KC 接种 6d 3weeks 滋养层细胞培养 优点 细胞接种密度低 增殖速度较快 细胞生长稳定 而且灭活的3T3细胞自身无生长能力 有利于接种的KC生长增殖 弊端 一反面可能会造成KC和3T3细胞的混合污染 另一方面存在着将3T3细胞DNA遗传信息整合入增殖的KC内的危险 无滋养层细胞培养 Wilkinson等 1987 率先用无滋养层方法成功分离培养了狗KC 皮肤组织 分离酶 4 孵育18h 表皮 KC 培养 传代 20 孵育45min 特定培养基 吸管吹吸 无滋养层细胞培养 Hager等 1999 用无滋养层方法成功分离培养了小鼠KC 并将其传至第19代 但只有前10代细胞具有分化能力 真皮 胶原酶 纱布过滤 离心 混合细胞 成纤维细胞 成纤维细胞条件培养基 HCM EMEM 06 EMEM 06 1 1 KC培养基 无滋养层细胞培养 Caldelari等 2000 在Wilkinson方法基础上成功分离培养了17 5d小鼠胚胎KC 并在传至第61代依然保持分化活性 17 5d小鼠胚胎皮肤 分离酶 definedkeratinocyte SFM 表皮 KC 培养 传代 剪碎 胰酶消化 definedkeratinocyte SFM 提高Ca2 浓度后 Keratin和E cadherin表达呈阳性 且浆膜外形成排列紧密的角蛋白网络 细胞间形成稳定的连接结构 说明细胞仍保持分化活力 无滋养层细胞培养 有学者认为无滋养层培养的细胞缺少分化标记物 中间丝蛋白 张力原纤维和桥粒 的表达 Prignano等 1999 小鼠KC在培养30代后会出现非整倍型染色体 四 影响KC培养的因素 人为因素接种密度 传代时间培养基无血清培养基 霍乱毒素 CT 表皮生长因子 EGF 和钙离子 Ca2 影响KC培养的因素 1 霍乱毒素 CT CT是分子量为8400D的蛋白质 由A和B两个亚基组成 B亚基可将腺苷酸环化酶结合到细胞表面 A亚基可激活腺苷酸环化酶 Green 1978 发现浓度为10 11 10 9M的CT均可有效促进细胞生长 影响KC培养的因素 1 霍乱毒素 CT 说明当细胞密度较低时 CT可提高cAMP浓度并促进细胞增殖 当细胞密度增高时 CT可降低cAMP浓度 从而抑制高密度细胞生长 Natsuko等 1982 细胞密度较低时 CT可促进DNA和蛋白质合成 细胞密度增加后 CT抑制DNA和蛋白质合成 向培养基中加入浓度范围为10 14 10 8M的CT后6h 可成百倍的提高胞内cAMP浓度 影响KC培养的因素 2 表皮生长因子 EGF EGF是分子量为6045D的多聚肽 最先由Cohen 1962 从鼠颌下腺中分离 并发现其具有促进新生小鼠表皮生长和成熟的作用 Rheinwald等 1977 将EGF加入KC培养基后发现 EGF不仅可以促进KC生长 还能增加其寿命 影响KC培养的因素 2 表皮生长因子 EGF Wilkinson等 1987 也发现EGF可促进狗KC增殖 而且EGF和CT具有协同效应 影响KC培养的因素 2 表皮生长因子 EGF Miguel等 2001 的发现说明EGF主要通过提高端粒酶的活性来延缓细胞衰老 细胞每次分裂 端粒会缩短一点 当端粒消耗完之后 细胞便会凋亡 而端粒酶可阻止端粒缩短 也就是说端粒酶可延缓细胞凋亡 影响KC培养的因素 3 钙离子 Ca2 Hennings等 1980 发现在低Ca2 浓度 0 09mM 中 KC以单层形式聚合 并形成 铺路石 样 在高Ca2 浓度 1 14mM 中时 KC会向垂直方向角化并形成4 5层细胞 随后从培养皿上脱落 接种后5d 增殖细胞比例不到60 0 09mMKC增殖 1 14mMKC已分化 最先被发现生长受到钙离子影响的细胞是鼠3T3细胞 Boynton等 1974 和人WI 38成纤维细胞 Boynton等 1977 作者发现 当钙离子浓度低于0 5mM时 这两种细胞生长均受到抑制 影响KC培养的因素 3 钙离子 Ca2 Ca2 浓度小于0 3mM时 细胞数量增多 大于0 3mM时 细胞数量减少 Ca2 浓度小于0 3mM时 含有角化包膜细胞比例较少 大于0 3mM时 含有角化包膜细胞比例增多 说明Ca2 浓度大于0 3mM时 Ca2 会抑制细胞增殖并促进细胞分化 Steven 等 1983 影响KC培养的因素 3 钙离子 Ca2 1 25 D3可通过诱导PLC 1表达来促进involucrin和transglutaminase表达 1 25 D3可通过诱导PLC 1表达来提升胞内Ca2 浓度 说明1 25 D3可通过诱导PLC 1表达来提升胞内Ca2 浓度 最后促进involucrin和transglutaminase表达 引起细胞分化 Xie 等 2001 影响KC培养的因素 霍乱毒素 CT 当细胞密度较低时 CT可提高cAMP浓度