实验三 蛋白质的盐析分离和凝胶层析

蛋白质的盐析分离和凝胶层析脱盐 蛋白质的盐析分级分离SephadexG 25脱盐盐离子的跟踪检测 检测蛋白质 蛋白质提取 分离 纯化及鉴定技术 材料 取材一定要新鲜 在低温下操作破细胞 匀浆器 研钵 超声波 反复冻融 化学方法 酶解等蛋白质提取 根据物质的性质 水 盐溶液 稀酸 稀碱 有机溶剂蛋白质分级分离 盐析分级分离 有机溶剂分级分离 等电点分离进一步纯化 透析 柱层析 分子筛 离子交换 亲和层析 HPLC鉴定电泳 薄层电泳 纸 NC膜 凝胶电泳 PAG 琼脂 淀粉 结构分析 活性分析 呈色反应含量测定 fonlin酚法 考马斯亮蓝G250法等 一些常用的蛋白质纯化中的仪器 机械细胞破碎仪 超声波细胞破碎仪 色谱工作站WINDOWS98作为色谱分析的数据采集和处理 后端采用数据库工具MS SQL在网络上进行分析结果的存档 检索及打印等 高效液相色谱仪 蛋白质的盐析分离原理 用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程称为蛋白质的盐析作用 蛋白质是亲水胶体 在高浓度的中性盐影响下脱去水化层 同时 蛋白质分子所带的电荷被中和 结果蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出 经透析或用水稀释时又可溶解 故蛋白质的盐析作用是可逆过程 分子量大的蛋白质 如球蛋白 比分子量小的 如白蛋白 易于析出 改变盐浓度 使不同分子量的蛋白质分别析出 凝胶层析原理 凝胶层析又称排阻层析 凝胶过滤 渗透层析或分子筛层析等 对于某种型号的凝胶 一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外 只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外 所用洗脱液的体积为外水体积 而一些小分子不被排阻 可自由扩散 渗透进入凝胶内部的筛孔 尔后又被流出的洗脱液带走 所用洗脱液的体积为内水体积 分子越小 进入凝胶内部越深 所走的路程越多 故小分子最后流出柱外 而大分子先从柱中流出 一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间 只能进入一部分凝胶较大的孔隙 亦即部分排阻 因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大 小分子之间 这样样品经过凝胶层析后 分子便按照从大到小的顺序依次流出 达到分离的目的 凝胶层析载体 用作凝胶的载体物质有交联葡聚糖 聚丙烯酰胺和琼脂糖等 使用最多的是交联葡聚糖 交联葡聚糖的商品名为Sephadex 是由链状葡聚糖通过交联剂1 氯代 2 3 环氧丙烷交联而成 交联剂添加越多 孔径越小 吸水量也越小 反之越大 以G x表示型号 后面的数字可以看出交联度 数字越小 胶联度越大 SephadexG 25粗 吸水量2 5ml g 干粒子直径100 300 m 筛孔40 60 大部分蛋白质分子从外水体积流出 盐等小分子从内水体积流出 实验一卵球蛋白的盐析分离 0 7ml卵清 0 7ml饱和硫酸铵溶液 每组2个EP管 混合均匀 避免产生气泡 静置3 5分钟 蛋白质析出 3000rpm 离心3分钟 用移液枪去除上清 含卵清蛋白 1 0ml水充分溶解卵球蛋白沉淀 3000rpm 离心3分钟 将两管上清合并 即为样品 加50 硫酸铵溶液1 5ml洗涤 3000rpm 离心3分钟 用移液枪去除上清 实验步骤 二 卵球蛋白的脱盐 安装 固定层析柱 安装排水管 止水夹和螺旋夹 排气泡 准备凝胶悬液 装柱 将准备好的凝胶悬液一次性装入层析柱中 同时打开下端的止水夹 调节流速 1d 5sec 要求柱高25cm左右 要求 平衡 上样 收集 1 5ml 离心管 上样后立即开始收集 测定吸收值和硫酸根离子 取样品1ml加入2ml蒸馏水稀释 先测定吸收值 然后去适量测定硫酸根离子 记录 注意事项实验完毕后 将凝胶全部回收处理 以备下次实验使用 严禁将凝胶丢弃或倒入水池中 样品溶液的浓度大一些好 但粘度不宜大 加样体积通常为凝胶柱床体积的1 10 洗脱用的液体与凝胶溶涨和凝胶平衡时所用的一样 洗脱速度要恒定 凝胶暂时不用时 要加防腐剂 如0 02 叠氮化钠溶液 再次使用凝胶时可再生后使用 蛋白质洗脱曲线记录方式 洗脱体积 吸收值 盐离子检测方法 用醋酸钡检测溶液中的硫酸根离子 灵敏度高 与溶液中的硫酸根离子可以形成白色的沉淀 同时不能同蛋白质形成沉淀 实验中要设对照 即加入双蒸水和醋酸钡检测溶液 为什么不用氯化钡 因为氯化钡易同蛋白