（优质课件）白血病分子生物学

白血病分子生物学 1 白血病分子生物学 白血病的分子机制白血病的分子检测白血病分子检测的临床应用 2 白血病的分子机制 基因 gene 合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核酸序列 癌基因 oncogene 细胞或病毒中存在的 能诱导正常细胞转化并使之获得新生物特征的基因 癌基因活化的方式 点突变染色体重排基因扩增抑癌基因 tumorsuppressorgenes 指一类基因 其产物对细胞生长增殖起负调控的作用 并能潜在抑制细胞的恶变 3 白血病的分子机制 4 白血病的分子机制 增殖过度分化阻断凋亡受抑 5 二次打击 学说 D GaryGillilandBestPractice16 409 417 6 白血病的分子检测 SouthernblotNorthernblotWesternblotFISHPCR测序芯片 7 白血病的分子检测 PCR反应原理 8 N N0 x 1 E nN 扩增子数量N0 起始模板数量E 扩增效率n 循环数 白血病的分子检测 PCR理论方程 9 白血病的分子检测 PCR方法优点快速灵敏特异PCR方法缺点假阳性假阴性 10 白血病的分子检测 PCR 仅适用于染色体断裂点丛集于相对小的范围内 2kb 如T ALL中SIL TAL1 RT PCR 可用于染色体断裂点跨越很大的区域的融合基因 巢式RT PCR 可显著提高反应的特异性 增加扩增效率 RQ PCR 可定量扩增产物 11 白血病的分子检测 RQ PCR Real timeQuantitativePCR 荧光标记扩增产物荧光标记引物特异性荧光标记探针TaqMan探针 分子信标 杂交双探针荧光染料直接结合扩增产物SYBRGreenI与DNA双链结合动态监测荧光信号变化 12 TaqMan探针法 特异性高多重基因定量成本较高 13 SYBRGreenI法 成本低最适合初步筛查熔解曲线功能无法多重检测无模板特异性灵敏度低 14 白血病的分子检测 CT值 荧光信号有统计学意义显著增长 穿过阈值线 时的循环次数CT值与起始模板量成反比 15 白血病的分子检测 RQ PCR的检测系统 该系统内置了96孔PCR仪 且在每个反应孔上均有一个监测探头用于检测PCR反应管中的荧光强度 平均每8 12秒就检测一次 以达到实时检测的目的 系统中的电脑系统同时不断地分析来自检测系统的信息 不断计算每个反应管中的荧光强度 并最终得到CT值 该系统可以根据标准品的CT值和拷贝数自动绘制标准曲线 并计算未知样品中的目的基因拷贝数 16 白血病的分子检测 RQ PCR方法优点 灵敏而特异起点定量闭管化学 污染的风险低 没有PCR后处理 无需走胶 拍照等 高度自动化定性 单数据点测定定量 多数据点测定能做基因分型及SNP鉴定 17 RQ PCR的操作流程 从细胞或组织中抽提DNA或RNA 用PCR或RT PCR扩增特异片段 将PCR产物克隆到合适的载体上 纯化 定量和系列稀释质粒DNA或RNA 体外转录成RNA片段 仅用于RNA样品 构建标准曲线 CT lgcopy 样品的定量检测 校正样品基因拷贝数 18 19 白血病分子检测的临床应用 白血病的分子生物学检查对白血病诊断分型及预后判断有以下几方面意义 补充MIC检查的不足发现新的亚型监测白血病的微小残留病灶 MRD 为研究白血病的发病机制打下基础 20 白血病分子检测的临床应用 PCR方法检测MRD常用的分子标志 21 AML1 ETO t 8 21 q22 q22 6 8 原发性AML 在M2中的阳性率为20 40 在M2b中阳性率为90 少见于M4和M1 极少见于MDS和骨髓增生综合症AML1 ETO 白血病细胞有一定程度的分化能力 能分化至较成熟的嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞 且对化疗反应较敏感AML1 ETO 患者对大剂量阿糖胞苷治疗效果好 具有较高的缓解率 无病生存期长 预后较其他AML亚型 M3除外 好 22 AML1 ETO 对初发患者进行t 8 21 和AML1 ETO融合基因的检测对其预后判断及治疗方案的制定相当重要AML1 ETO定性结果不能用于评价患者MRD情况RQ PCR能实时反映体内AML1 ETO水平 连续定量AML1 ETO转录本水平可判定有高复发风险的患者 以便及早治疗干预以防血液学复发 23 AML1 阴性ETO 24 C KIT基因突变 C KIT为III型受体酪氨酸激酶家族 还包括c FMS PDGFR 和c KIT 成员之一AML1 ETO可诱导性表达的转基因小鼠 并不导致白血病发生C KIT突变可见于伴inv 16 的M4以及伴t 8 21 的M2患者26 54例 48 1 M2b患者中检测到C KIT基因突变57例不伴t 8 21 的其他类型血液肿瘤患者均未检测到C KIT基因突变以上结果提示C KIT突变与M2b密切相关 R 0 94 P 0 01 25 C KIT基因突变 C KIT基因结构 JM 26 C KIT基因突变 外周血白细胞计数 27 C KIT基因突变 生存曲线 28 PML RAR t 15 17 q22 q21 98 M3患者继t 15 17 之后 又先后发现4种M3特异的累及RAR 的变异性染色体易位 t 11 17 q23 q21 t 5 17 q35 q21 t 11 17 q13 q21 以及dup 17 q21 3 q23 分别产生PLZF RAR NPM RAR NuMA RAR 和STAT5b RAR 融合基因临床上 具有PLZF RAR 或STAT5b RAR 融合基因患者对ATRA治疗不敏感 其余三种染色体易位患者经ATRA治疗可获完全缓解 29 PML RAR APL累及的RAR 基因及其伙伴基因结构示意图 30 PML RAR 由于PML基因断裂点不同产生3种不同的PML RAR 异构体约55 的M3患者为L型 40 为S型 5 为V型 且每位患者只表达一种PML RAR 融合蛋白形态学上S型白血病细胞常为低分化的并且这些患者可见继发细胞遗传学异常 V型APL患者的白血病细胞体外对ATRA的敏感度低 31 PML RAR RT PCR检测PML RAR 是敏感且特异的APL诊断方法 还能用于治疗后MRD监测 PML RAR 阳性提示的分子复发常早于临床复发3 6个月 为临床采取进一步治疗措施提供了保障RQ PCR能有效反映患者在发病 治疗 缓解 复发整个过程的白血病细胞负荷 在MRD监测中比RT PCR具有更高价值 32 L 阴性S 33 FLT3基因突变 Fms relatedtyrosinekinase3FLT3为III型受体酪氨酸激酶家族 还包括c FMS PDGFR 和c KIT 成员之一 该类受体因在造血过程中造血细胞的增殖和存活中发挥重要调控作用综合国外各研究报道 FLT3 ITD和D835突变在AML中阳性率分别为24 385 1585 和7 30 429 总阳性率超过30 使其成为AML中最普遍发生突变的靶基因许多临床研究发现 FLT3突变还与临床预后密切相关 尤对60岁以下的AML患者 FLT3突变患者预后较差 且可独立于核型之外 34 FLT3基因突变 35 FLT3基因突变 FLT3基因主要突变类型 36 FLT3基因突变 mut FLT3信号通路 37 FLT3基因突变 外周血白细胞计数 38 CBF MYH11 inv 16 p13 q22 及t 16 16 p13 q22 主要见于M4Eo 10 不伴异常嗜酸细胞M4 少见于M2CBF MYH11融合蛋白通过干扰核心结合因子 corebindingfactor CBF 的转录激活作用而致病具有CBF MYH11的患者对化疗敏感 预后较好 故提高检测率尤具临床意义 39 CBF MYH11 CBF MYH11具有多种变异型 其中最常见的为A型 占80 RT PCR检测CBF MYH11进行MRD监测显示 大部分患者在完全缓解时PCR转阴 但仍有小部分长期存活者PCR仍为阳性最新研究采用RQ PCR检测CBF MYH11转录本水平来评价M4Eo患者MRD情况 预示复发 40 41 NPM基因突变 Nucleophosmin 为核 浆穿梭蛋白 调控p53 ARF通路见于 50 核型正常的AML患者 而在伴低危 高危核型患者中极少见主要见于M4 M5中第12号外显子的插入 缺失伴此突变患者WBC计数高目前 此突变的预后价值各研究组报道不一 尚待进一步证实 42 DEK CAN t 6 9 p23 q34 主要见于M2或M4 也见于M1 MDS RAEB伴DEK CAN的患者年龄一般较轻 且预后较差此类患者进行分子监测有助于判断患者预后 调整治疗方案 43 N RAS基因突变 为RAS基因家族成员之一 染色体定位于1p32 2 具有GTP GDP结合和GTPase活性 调控正常细胞的生长此基因突变存在于11 30 AML突变热点位于codon12 13和61在inv 16 t 16 16 inv 3 t 3 3 中突变率较高 而在t 15 17 中低伴此突变患者外周血WBC计数低该突变预后意义尚不明 44 WT 1基因高表达 Wilmstumor1是无特异分子异常的急性白血病患者理想的MRD检测指标伴此基因高表达者预后差 且表达程度与预后相关 45 BCR ABL t 9 22 q34 q11 15 30 成人ALL及3 5 儿童ALL9号染色体的断裂点与CML相同 但22号染色体断裂点具有异质性此融合蛋白p190刺激细胞增殖的能力比p210要强 在转基因试验中观察到p190诱发的白血病具有起病早 发展快和恶性程度高的特点BCR ABL ALL患者预后差 5年存活率 20 因此这些患者在缓解后需进行骨髓移植治疗 46 BCR ABL 对于自体或异体移植ALL患者 移植前后BCR ABL的有无以及BCR ABL的转录本类型与预后有关 47 e1a2 阴性 48 E2A PBX1 t 1 19 q23 p13 5 6 儿童ALL和3 成人ALL此类患者具有高的白细胞计数 高的血清乳酸脱氢酶及中枢神经系统症状 预后差 平均无病生存期 DFS 仅6个月 3年DFS为20 需给予这些患者强化治疗才能获得较好的预后核型和E2A PBX1检测对此类患者的诊断和治疗方案的选择至关重要E2A PBX1的预后价值需更多的临床研究证实 49 50 TEL AML1 t 12 21 p13 q22 25 儿童ALL 是儿童ALL中最常见的分子异常目前为止尚未在T ALL AML或NHL中发现t 12 21 在婴儿白血病中极少报道 在成人白血病患者中频率很低 2 此类患者发病年龄小 2岁 10岁 WBC计数低 50000 L 免疫表型为前B ALL此类患者对治疗反应佳 完全缓解时间长 预后好 51 TEL AML1 由于12p和21q末端在常规显带中很相似 因此常规细胞遗传学方法检出率仅0 05 需应用FISH或RT PCR方法提高检测阳性率TEL基因重排是独立预后因素 RT PCR检测TEL AML1融合基因能将低危险度与高危险度的ALL患者区分开来 因此早期检测TEL AML1融合基因对临床预后 确定合适的治疗方案都有重要意义 52 53 MLL相关融合基因 累及MLL基因的分子异常见于5 2 AML 22 ALL和混合性白血病及某些淋巴瘤 还可见于治疗相关白血病 尤接受topoisomeraseII抑制剂治疗的患者MLL基因涉及五十余种染色体易位 产生不同的融合蛋白 且每种融合蛋白都与特定的白血病表型相关 最常见的有 t 4 11 q21 q23 MLL AF4融合基因ALLt 9 11 p22 q23 MLL AF9融合基因AMLt 11 19 p13 q23 MLL ENL融合基因AML及ALL 54 MLL相关融合基因 至今 MLL相关融合蛋白的致病性还不清楚 推测其可能具有双重作用 融合蛋白可能获得新的功能 促使细胞转化 MLL发生断裂后 缺失锌指结构域的MLL不能与DNA结合 失去其转录活化功能 使受MLL调节的靶基因 HOX基因 表达异常 也影响造血细胞的发育 55 MLL AF4 t 4 11 q21 q23 t 4 11 的发生率在不同年龄段是不同的 在婴儿ALL中最多见 为50 70 而在儿童和成人中较低 分别为2 和3 6 此类患者发病年龄低 通常 2岁 白细胞计数高 常伴有内脏巨大并累及中枢神经系统此类患者病情凶险 预后差 患者对标准治疗方案很可能无效 需给予强化治疗 目前应用高剂量Ara C治疗 使这些患者预后有所提高 56 MLL AF4 对 2岁的婴幼儿急性白血病患者应常规进行MLL AF4融合基因的检测以筛选出高危患者 给予强化治疗提高生存率RT PCR可在所有t 4 11 患者初发时检测到MLL AF4融合基因 由于该融合基因累及的2个基因的断裂点变异性较大 因此PCR应包括所有断裂点以免产生假阴性结果 57 58 TAL1基因重排 t 1 14 p32 q11 TAL1 TCR 融合基因3 T ALL易位使TAL1基因与TCR 位点并置 其5 端正常转录调节被TCR 5 部分所取代 而后者在T细胞中有高表达 59 TAL1基因重排 1p32缺失 SIL TAL1融合基因16 26 T ALL该重组仅见于T ALL 是T ALL的一个有用的克隆标志缺失部分可能为TAL1基因的调控序列 使TAL1基因表达失控 导致与染色体易位相似的表型常规遗传学方法检测不到这一异常 而SIL TAL1融合处特异的序列能作为这类患者特异的分子标志用于PCR检测 60 61 TAL1基因重排 TAL1异常仅见于T ALL 尚未见于B ALL AML和T细胞NHL 是儿童T ALL中最常见非随机遗传缺陷 是监测大多数T ALL的侯选基因伴TAL1异常的患者血象表现为高白细胞计数 高血红蛋白含量 免疫表型为CD2 CD10 尽管在治疗反应上 有TAL1重排患者和无TAL1重排患者无显著差异 但伴TAL1重排患者4年无事件生存率 EFS 高于不伴TAL1重排的患者 分别为59 11 和44 7 提示伴TAL1重排患者预后较好 62 HOX11基因异常表达 t 10 14 q24 q11 t 7 10 q34 q24 7 的T ALL易位使HOX11基因受控于TCR 和TCR 基因调控序列 导致其异常表达另有部分HOX11高表达患者核型正常伴有此种异常的患者对联合化疗反应好 预后也较其他T ALL患者要好 完全缓解率为100 平均无病生存期为46个月 3年无病生存率为75 63 HOX11L2基因异常表达 t 5 14 q35 q32 20 的儿童T ALL易位使HOX11L2基因处于CTIP2调控元件的控制下 而CTIP2基因在T淋巴细胞分化时高度表达在随访患者中检测到高水平HOX11L2说明白血病细胞的存在 强烈预示复发 而完全缓解患者HOX11L2表达水平迅速降低 并维持在一个低水平 可见HOX11L2的表达水平可作为MRD检测的标志 64 NOTCH1基因突变 NOTCH1信号对CLP commonlymphoidprogenitors 向T细胞定向以及前T细胞受体复合物组装是必须的35 50 T ALL患者存在此基因突变伴NOTCH1基因突变的成年T ALL患者预后较差 65 NOTCH1基因突变 NOTCH1基因结构 66 NOTCH1基因突变 生存曲线 67 BCR ABL t 9 22 q34 q11 90 CML患者BCR ABL融合蛋白 p210 的酪氨酸蛋白激酶活性较正常ABL高 可能是BCR对ABL激酶活性调节区的作用所致由于 5 CML患者为隐匿性Ph染色体 因此无Ph染色体CML患者还需使用更灵敏的分子检测手段如FISH或RT PCR检测BCR ABL融合基因RT PCR还能区分e1 a2和b2 a2 b3 a2二种BCR ABL转录本 从而区分ALL患者与CML急淋变患者 进而分别对两种不同患者采用不同的治疗方案 68 BCR ABL 巢式RT PCR检测BCR ABL融合基因用于CML移植患者移植后MRD监测 可在患者血液学复发前的6 24个月骨髓检测就呈阳性 RQ PCR还能动态观察患者治疗后BCR ABL转录本水平变化情况 反映疗效 69 b3a2 b2a2 阴性 70 GATA2基因突变 调控早期造血干细胞增殖分化的转录因子 维持造血干祖细胞的增殖和自我更新能力CML急变患者中新发现GATA2基因突变 而CML慢性期 加速期 AML M1 M7 MDS ALL CLL 淋巴瘤和骨髓瘤患者 以及正常对照均未发现该突变 可见GATA2基因突变仅与CML急变相关 是CML疾病进展过程中的获得性突变 总发生率为12 5 5 40 且均造成CML急粒单变GATA2基因突变与CML患者疾病进展和预后的关系有待进一步阐明 71 JAK2基因突变 Januskinase2此基因突变主要见于MPD和MDS 另可存在于部分AML尤M2突变为V617F突变去除了JAK2JH2负性调控 导致该基因的持续活化 赋予细胞增殖存活优势JAK2可成为靶向治疗的靶点 72 MDS相关基因异常 Delta样 Dlk 基因编码Dlk蛋白在MDS明显增高者55 而AML仅10 可能是MDS特异性基因 但作为诊断MDS的标志基因尚待进一步确定 73 MDS相关基因异常 RAS此原癌基因超家族编码鸟苷三磷酸水解酶 GTPase 调节细胞生长相关信号ras癌基因的活化 尤其是N ras的激活可在约35 的MDS患者中发生FMS为集落刺激因子1 控制单核 巨噬细胞生长 分化及功能fms基因的突变可在16 的MDS患者中发现ras和fms突变主要见于粒 单细胞分化的疾病 即MDS中的CMML 患者生存期短 转AML多 74 MDS相关基因异常 p53在MDS时 p53突变较少见 5 但在较为进展的病例中可高达15 p53突变意味着化疗耐药和生存期缩短 因而是一