MTT所有问题大汇总

精品文档 1欢迎下载 实验前应明确的问题实验前应明确的问题 1 选择适当的细胞接种浓度 一般情况下 96 孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有 105 个细胞 但由于不同细胞贴壁后面积差异很大 因此 在进行 MTT 试验前 要进行预实验 检测其贴壁率 倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线 确定试验中每孔的接种 细胞数和培养时间 以保证培养终止致细胞过满 这样 才能保证 MTT 结晶形成酌量与细 胞数呈的线性关系 否则细胞数太多敏感性降低 太少观察不到差异 2 药物浓度的设定 一定要多看文献 参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛 根据 自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛 切记 否则 可能你用的时间和浓度根本不 是药物的有效浓度和时间 3 时间点的设定 在不同时间点的测定 OD 值 输入 excel 表 最后得到不同时间点的抑 制率变化情况 画出变化的曲线 曲线什么时候变得平坦了 到了平台期 那个时间点应 该就是最好的时间点 因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显 4 培养时间 200ul 的培养液对于 10 的 4 5 次方的增殖期细胞来说 很难维持 68h 如果 营养不够的话 细胞会由增殖期渐渐趋向 G0 期而趋于静止 影响结果 我们是在 48h 换液 的 5 MTT 法只能测定细胞相对数和相对活力 不能测定细胞绝对数 做 MTT 时 尽量无菌操 作 因为细菌也可以导致 MTT 比色 OD 值的升高 6 理论未必都是对的 要根据自己的实际情况调整 7 实验时应设置调零孔 对照孔 加药孔 调零孔加培养基 MTT 二甲基亚砜 对照孔 和加药孔都要加细胞 培养液 MTT 二甲基亚砜 不同的是对照孔加溶解药物的介质 而 加药组加入不同浓度的药物 8 避免血清干扰 用含 15 胎牛血清培养液培养细胞时 高的血清物质会影响试验孔的光 吸收值 由于试验本底增加 会试验敏感性 因此 一般选小于 10 胎牛血清的培养液进 行 在呈色后 尽量吸净培养孔内残余培养液 实验步骤实验步骤 贴壁细胞 贴壁细胞 1 收集对数期细胞 调整细胞悬液浓度 每孔加入 100ul 铺板使待测细胞调密度至 1000 10000 孔 边缘孔用无菌 PBS 填充 2 5 CO2 37 孵育 至细胞单层铺满孔底 96 孔平底板 加入浓度梯度的药物 原则 上 细胞贴壁后即可加药 或两小时 或半天时间 但我们常在前一天下午铺板 次日上 精品文档 2欢迎下载 午加药 一般 5 7 个梯度 每孔 100ul 设 3 5 个复孔 建议设 5 个 否则难以反应真实情 况 3 5 CO2 37 孵育 16 48 小时 倒置显微镜下观察 4 每孔加入 20ulMTT 溶液 5mg ml 即 0 5 MTT 继续培养 4h 若药物与 MTT 能够反应 可先离心后弃去培养液 小心用 PBS 冲 2 3 遍后 再加入含 MTT 的培养液 5 终止培养 小心吸去孔内培养液 6 每孔加入 150ul 二甲基亚砜 置摇床上低速振荡 10min 使结晶物充分溶解 在酶联免 疫检测仪 OD490nm 处测量各孔的吸光值 7 同时设置调零孔 培养基 MTT 二甲基亚砜 对照孔 细胞 相同浓度的药物溶解 介质 培养液 MTT 二甲基亚砜 悬浮细胞 悬浮细胞 1 收集对数期细胞 调节细胞悬液浓度 1 106 ml 按次序将 补足的 1640 无血清 培 养基 40ul 加 Actinomycin D 有毒性 10ul 用培养液稀释 储存液 100ug ml 需预 试寻找最佳稀释度 1 10 1 20 需检测物 10ul 细胞悬液 50ul 即 5 104cell 孔 共 100ul 加入到 96 孔板 边缘孔用无菌水填充 每板设对照 加 100ul 1640 2 置 37 5 CO2孵育 16 48 小时 倒置显微镜下观察 3 每孔加入 10 ul MTT 溶液 5 mg ml 即 0 5 MTT 继续培养 4 h 悬浮细胞推荐使 用 WST 1 培养 4 h 后可跳过步骤 4 直接酶联免疫检测仪 OD570nm 630nm 校准 测量 各孔的吸光值 4 离心 1000 转 x10min 小心吸掉上清 每孔加入 100 ul 二甲基亚砜 置摇床上低速 振荡 10 min 使结晶物充分溶解 在酶联免疫检测仪 OD570nm 630nm 校准 测量各孔的 吸光值 5 同时设置调零孔 培养基 MTT 二甲基亚砜 对照孔 细胞 相同浓度的药物溶解 介质 培养液 MTT 二甲基亚砜 每组设定 3 复孔 MTTMTT 的配制的配制 MTT 一般最好现用现配 过滤后 4oC 避光保存两周内有效 或配制成 5mg ml 保存在 20 度 长期保存 避免反复冻融 最好小剂量分装 用避光袋或是黑纸 锡箔纸包住避光以免分 解 我一般都把 MTT 粉分装在 EP 管里 用的时候现配 直接往培养板中加 没必要一下子 配那么多 尤其当 MTT 变为灰绿色时就绝对不能再用了 精品文档 3欢迎下载 MTT 有致癌性 用的时候小心 有条件最好带那种透明的簿膜手套 配成的 MTT 需要无菌 MTT 对菌很敏感 往 96 孔板加时不避光也没有关系 毕竟时间较短 或者你不放心的时候 可以把操作台上的照明灯关掉 配制 MTT 时用用 PBS 溶解 也有人用生理盐水配 60 水浴助溶 PBS 配方 NaCl 8g Kcl 0 2g Na2HPO4 1 44g KH2PO4 0 24g 调 ph 7 4 定容 1L 关于细胞的接种 铺板 细胞过了 30 代以后就不要用了 因为状态不好了 培养板要用好的 最好进口板 不好 的板或重复利用的板只可做预实验 接种时最好按照预实验摸索出的密度接种 因为细胞密度在 10000 ml 左右时 所测得的 OD 值的区间即细胞抑制率 或者增值率 的所呈现的线性关系最好 结果最可信 如果铺 的太稀细胞的杀伤不会很明显 太密细胞可能都会凋亡 因为细胞长的太快营养会不够 最后导致死亡 且而细胞过密或者过少 增殖都会过快或者过慢 其增值率线性关系不佳 故而 MTT 细胞密度多采用 10000 ml 100ul 孔 细胞密度要根据不同细胞的特点来定 如果你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点的细 胞浓度 如果你做的药品对细胞具有抑制作用那么取大点的细胞浓度 这样与对照的区别 更明显 数据更好 悬浮细胞每孔的细胞数可达到 105 贴壁细胞可为 103 104 其它的声音 其它的声音 1 首先细胞的接种密度一定不能过大 一般每孔 1000 个左右就够了 我认为宁少勿多 尤其是对于肿瘤细胞 10000 孔是太高了 这样即使药物有作用 MTT 方法也是表现不出 的 最佳点板浓度在 4000 5000 孔 太少的话 SD 值会很大 2 MTT 本身就是比较粗的实验 增殖率 10 左右的波动都不算奇怪 特别是新手 20 的波 动也是常见的 所以很可能是技术原因引起的 特别是种板技术一定要过关 精品文档 4欢迎下载 3 我做的是肿瘤细胞的 MTT 实验 这种细胞长的很快一开始我是用 100000 ML 的浓度来接 种的 结果细胞长的太满结果是没有梯度也没有线性关系 后来调整浓度 用过 40000 800 00 ML 的浓度都做过 MTT 实验 结果发现做的结果比较好点的是 60000 70000 ML 的浓度组 的 用 40000 M 的浓度的组 由于细胞少 药物作用的梯度还是有 只是没有很好的线性关 系 还有根据细胞生长速度以及药物的特性 有时间依赖性和浓度依赖性的药物 来确定培 养时间是 48 小时还是 72 小时 注意细胞悬液一定要混匀 已避免细胞沉淀下来 导致每孔中的细胞数量不等 可以每接 几个就要再混匀一下 加样器操作要熟练 尽量避免人为误差 虽然移液器比移液管精确 得多 但是如果操作不熟 CV 会在 8 左右 另外 吹散次数过多也会影响细胞活力 所以 要熟练鞋 快些上板 首先说说我的一点经验 首先说说我的一点经验 1 吹打时悬液总量不能太多 达到吸管吸液量的 3 到 4 倍 可能比较容易混匀 10ml 的 离心管里面最好装 3 4ml 的悬液 悬液太少容易吹起很多气泡 悬液太多又不容易吹成单 细胞悬液 2 吸管的吸液量最好在 1ml 左右 吸液量过多的话 一下吸起很多液体 管中所剩就很少 这样吹打容易起泡 吸液量过少 吹打的力度就不够 吹打就会不均匀 如果是吸液量 1ml 多的吸管 总液量在 5ml 左右为益 3 吸的时候要在悬液底部 然后提起来一点 但是吹下去的时候不要离开液面 否则容易 吹打出气泡 4 吹打次数 100 左右 就可以吹打均匀了 有人认为加细胞前吹打 30 50 次基本就差不多 均匀了 加细胞的时候每接种 2 孔反复吹打 3 次 每吹打 3 次后枪头垂悬与细胞悬液中 5 秒钟 然后再以一定的速度吸取悬液 5 向每孔中用枪头加入细胞时不要太快 否则你会发现细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲 力在孔底聚集一堆 一般都在孔的底部中央 而周边很少 这种不均匀的分散会产生接触 抑制 影响细胞的生长 所以速度不能太快也不能太慢 我习惯每块板加完后平握手中 向左 3 下 向右 3 下 在往返回复 3 下移动 目的是使得细胞能分散的均匀些 铺板技 术是 MTT 实验的关键 也是基础 一定要练好 曾经有同学用漩涡振荡器混匀细胞 最后 细胞全死了 建议不要采用这种方法混匀细胞 加入加入 MTTMTT 精品文档 5欢迎下载 个人认为 MTT 最关键的是你的细胞数目和你加入真正起作用的的 MTT 的适当比例 具体细 胞数目和真正起作用的的 MTT 之间的关系确实不好确定 我认为 MTT 多加一些比少加好一 些 MTT 的量各家报道不同 一般是过量的 所以 10ul 即够了 如果不使用 96 孔板 培养基 超过 100ul MTT 按照 10 的比例加入 加入 MTT 以后振荡一下让 MTT 与培养基混匀 不过 这个应该关系不大 如加入 MTT 后都有个别孔立即变为蓝黑色 则污染的可能性極大 另外 MTT 稀釋後加入細 胞前還是需要以過濾的方式滅菌為宜 且在加 MTT 前可以先在镜下观察 看看是否有孔染菌 染菌的孔常常是临近的 因为血清中白蛋白对大部分的药物都有结合效应 所以可以单独将药物和 MTT 加在一起 看会不会起反应 如果不起反应 就不用去除含药物的培液 直接加 MTT 即可 如何清除上清如何清除上清 百家争鸣 百家争鸣 1 加 DMSO 前要把液体吸掉 但培养液里的紫色结晶可能会吸去 可在这之前先用平板离 心机离心 96 孔板 2000r 5 分钟 然后吸掉上清 如果是悬浮细胞 则推荐此法 悬浮 细胞要离心 2500rpm 10min 且其做 MTT 最好用圆底型 96 孔板 清除上清时注意不要把下 面的结晶颗粒吸掉 建议各孔吸弃 150 160ul 即可 2 我每次将 MTT 加入后 再孵育四个小时 然后用离心机离心 1000G 5min 但是用枪小 心地吸上清 还是会将一小部分蓝色结晶吸出 所以还是建议翻转倒扣的方法吧 3 另外 可以直接将板翻转倒扣 垫几层滤纸 2 3 次 比用 吸 的办法更不容易使细胞 脱离出来 可以轻拍 或者倾斜一点帮助吸液 发现紫色结晶几乎没有肉眼可见的掉脱 但前提是你本身细胞贴壁要比较牢 半贴壁生长的细胞容易脱离 假如药物作用时间长的 话 阴性对照组可能由于细胞过多而使加入 MTT 后形成的结晶漂起来 这样就不能直接倒 掉上清 4 做 MTT 时 这一步骤一定要小心 不要采用倒的方式 因为贴壁不牢的细胞会被倒掉 从而影响 OD 值 悬浮细胞 不要翻板 离心后也不要翻板 这个方法害死人 5 加完 MTT 反应 3 4h 后 从培养箱取出 96 孔板的动作要轻柔 避免振荡结晶 使其滑落 你 可以试着将 96 孔板倾斜 30 度角 然后用枪尖慢慢吸 有的细胞可以用排枪一起吸 有的 则要耐心的一个个用枪头吸 枪尖的力度和方向要保证每个孔都一致 不要让枪头接触到 孔底 且一旦倾斜孔板后就不要反复倾斜放平 这样也会使结晶脱落 精品文档 6欢迎下载 6 用医用的注射器加上针头吸取液体的 吸取时要把板子斜放 沿着壁吸取就好了 这次 MTT 我用 1ml 针头仔细吸培养液 觉得比其它方法可靠 一般不会吸走紫色结晶 避免清除上清而改进的方法 由于一般可离心 96 孔板的离心机不好找 既使是贴壁细胞做 MTT 时 用 DMSO 溶解得到结 果也不好 不是得不到预期结果就是可重复性差 解决方法解决方法 1 1 用以下文献方法 周建军等 评价抗癌物质活性的改良 MTT 方法 中国医药 工业杂志 1993 24 10 455 457 具体方法 配三联溶解液 10 SDS 5 异丁醇 0 012mol LHCL 蒸馏水溶解 三联溶解液 SDS10g 异丁醇 5ml 10M HCl 0 1ml 用双蒸水溶解配成 100ml 溶液 操作 在培养板上加一定密度的细胞悬液 90ul 孔 如需给药 则再于同时 悬浮细胞 或 4h 后 贴壁细胞 加入不同浓度的药物 10ul 孔 均设三复孔 另外 每块板上另没一 个调零孔 只加培养液 不含细胞和药物 培养 2d 后 加入 MTT 溶液 20ul 孔 继续培 养 4h 然后加入上述三联液 100ul 孔 于 37 度放置过夜后 用酶标仪测各孔 A570 值 优点 简化操作 提高了可靠性 解决方法解决方法 2 2 日本同仁有一种新试剂 CCK 8 试剂 CCK 8 试剂可用于简便而准确的细胞增 殖和毒性分析 其基本原理为 该试剂中含有 WST 8 其化学名称为 2 2 甲氧基 4 硝 基苯基 3 4 硝基苯基 5 2 4 二磺酸苯 2H 四唑单钠盐 它在电子载体 1 甲 氧基 5 甲基吩嗪 硫酸二甲酯 1 Methoxy PMS 的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为 具有高度水溶性的黄色甲染料 Formazan dye 生成的甲 物的数量与活细胞的数量成正 比 因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析 CCK 8 试剂中已预先配入了进行 细胞增殖和毒性分析所需的成分 无需再用缓冲液或培养基进行稀释 同时 CCK 8 试剂 无需任何放射性同位素和有机溶剂 因此 无需特别的技巧 就可使每一位使用者准确 快速地得到重现性好的实验结果 优 点 1 简 便 只需一步即可得到结果 2 省 时 毋需预制 即开即用 3 安 全 毋需放射性同位素和有机溶剂 4 快 速 省去了溶解除沉操作 精品文档 7欢迎下载 5 灵敏度高 灵敏度高于 MTT 6 重现性好 步骤少 无损失 结果准确 就是比较贵 如果经费充足 用这个是不错的 进行细胞增殖分析的使用方法 1 接种细胞悬液 100 l 于 96 孔板内 预先置于 37 5 CO 2 饱和湿度培养箱内培养 2 在每个孔内加入 10 l 的 CCK 8 试剂 3 把培养板放在培养箱内培养 1 4 小时 4 在 450nm 波长处测定吸光度 参比波长为 600nm 或 600nm 以上 解决方法解决方法 3 3 使用 MTS 解决方法解决方法 4 4 加入 DMSO 在同一批实验中最好不要更换 DMSO 加 DMSO 前把孔中液体尽量弃干净 没有去掉上清直 接加 DMSO 一是沉淀会很难溶解 二培养液的颜色在检测时也能被测到 会对最后结果造 成影响 但前提是不能把细胞也一起吸掉 因为这样带来的误差要远远大于培养液没弃干 净带来的误差 所以要在保证细胞不被吸掉的前提下 尽量把培养液吸掉 如果培养液没 弃干净 空白孔也要留有等量的培养液 这样在检测时可以尽量去除培养液的影响 DMSO 的量也可为 100ul 或 150ul 1 加了 DMSO 后用振荡器轻轻振荡 5 10min 时间控制尽量严格一点 放置时间长了会影 响结果 值会偏大 且结果不可信 2 加入 DMSO 后可用排枪反复抽吸助溶 溶解后尽快检测 如果实验孔不多 建议用此法 因其比振荡溶解效果好 3 或放入 37 度放孵箱 15 分钟溶解结晶 振荡是为了让甲臜溶解 这样才能更好的测量吸光度 振荡 96 孔板有专的振荡器 目的 扎破气泡 有气泡存在时 由于其对光的反射与折射作用 酶标仪的原理是通过测定特定波 长透过样品的吸光度推测样品内特定物质的浓度 会导致结果偏移 OD 值的测定 至于测定波长的选择是因显色溶液而异的 对于 DMSO 溶解后呈紫 红 色 490nm 有最 大吸收值 而 ATCC 公司的 MTT 试剂盒用的不是 DMSO 它的测定波长是 570 就如 ELISA 精品文档 8欢迎下载 实验选用 OPD 作底物测定波长是 492 选用 TMB 显色液则用 450 而对于 SDS 和酸化异丙 醇 则选用 570nm 并且建议以 655nm 作为参考波长 DMSO 溶后 10 分钟内测 越放颜色越深 而 SDS 做为溶解液测吸收光值 其值可在三天内 保持不变 细胞密度偏大测出的吸光度也会偏大 细胞密度小吸光度也会偏小 另外跟细胞状态也有 关系 细胞状态不好的话 吸光度值也会低的 细胞数目少 或者是培养的时间短 OD 值 也会偏低 如果各个孔的孔间差异性特别明显的话说明有可能存在污染 空白孔的 OD 值太 高 很可能是细菌污染 复孔直接的 OD 值差别一般应在 0 1 0 15 差别太大考虑 1 接种细胞数不均匀 或是接 种太多 应保证每孔一致 一般是每孔 1000 10000 个 可以细胞细胞计数后 加入细胞悬 液 再补培养基到预定体积 并轻轻吹打几次 使细胞均匀分布 这样比直接加入预定体 积的细胞悬液要好 接种时应加含血清培养基 2 贴壁时间 18 24h 如果不够 未悬浮 的细胞会被吸掉 一般为了实验的准确 每个浓度可以设 5 6 个复孔 可以最后统计时 可以除去一个最高 值和一个最低值 或者除去其中数据离谱的值 这些离谱数字的出现与细胞是否污染 细 胞是否在培养期间死去 是否培养液蒸发过多 加 MTT 液是否准确 在 37 5 二氧化碳 培养箱中孵育时间是否一定 1 4 小时 等有密切的关系 当然测定 OD 值的仪器工作状态 是否正常也非常重要 一般开机预热 20min MTT 方法的吸收度在 0 2 0 8 之间误差较小 这和分析化学中的 lambert beer 定律有关 对朗伯 比尔定律的偏离在吸光光度分析中 经常出现标准曲线不呈直线的情况 特别是当 吸光物质浓度较高时 明显地看到通过原点向浓度轴弯曲的现象 吸光度轴弯曲 这种 情况称为偏离朗伯 比尔定律 若在曲线弯曲部分进行定量 将会引起较大的误差 在吸光 光度分析中 仪器测量不准确也是误差的主要来源 任何光度计都有一定的测量误差 这 些误差可能来源于光源不稳定 实验条件偶然变动 读数不准确等 在光度计中 透射比的标尺刻度均匀 吸光度标尺刻度不均匀 对于同一仪器 读数的波 动对透射比为一定值 而对吸光度读数波动则不再为定值 吸光度越大 读数波动所引起 的吸光度误差也越大透射比很小或很大时 浓度测量误差都较大 即光度测量最好选吸光 度读数在刻度尺的中间而不落两端 待测溶液的透射比 T 在 15 65 之间 或使吸光度 A 在 0 2 0 8 之间 才能保证测量的相对误差较小 当 A 0 434 或透射比 T 36 8 时 测 量的相对误差最小 精品文档 9欢迎下载 其它的声音 其它的声音 1 最好用 570nm 波长的滤光片 因为 MTT 在这个波长的吸光度是峰值 换句话说灵敏度高 用其它波长的也有 一般是 490nm 但我的经验灵敏度降低一半 2 我们用的 BIO TEK 公司的 ELx800 一般值在 2 以下都是可靠的 如果复孔之间值相差 太大就要考虑是否是实验过程中的误差 我曾经看到园子的有些帖子报道说 OD 值大概在 0 2 1 2 范围内与活细胞数有较好的线性关系 但 OD 值在 0 3 0 9 范围内可能更佳 若你的 O D 值不在这个范围内则你实验的细胞数可能不太合适 应调整你的细胞数 边缘效应边缘效应 96 孔板四周一圈的孔一般只做空白 不养细胞 否则这四行的数据会偏高或偏低 96 孔板 在培养箱中 由于湿度不够 而培养箱由于具有一定的温度 由于温度梯度使得边缘的孔 水分蒸发较快 导致培养基中各种成分浓度变化增大 导致细胞状态不同 对于这种现象 要保证培养箱中的湿度 减少开关培养箱的次数和时间 解决方法 将孔板周围的一圈 孔全部不用 影响非常大 而且最外一圈一定要加水 PBS 或者培养液 只要能防止蒸发 就可以 关于如何计算关于如何计算 IC50IC50 1 1 改良寇式法 改良寇式法 lgIC50 Xm I P 3 Pm Pn 4 Xm lg 最大剂量 I lg 最大剂量 相临剂量 P 阳性反应率之和 Pm 最大阳性反应率 Pn 最小阳性反应率 举个例子 各组浓度 0 1 0 01 0 001 0 0001 0 00001 0 000001 稀释倍数为 10 最大浓度为 0 1 抑制率为 0 95 0 80 0 65 0 43 0 21 0 06 代入 计算公式 计算公式 Pm 0 95 Pn 0 06 P 0 95 0 80 0 65 0 43 0 21 0 06 3 1 Xm lg0 1 1 lgI lg0 1 0 01 1 精品文档 10欢迎下载 lgIC50 1 1 3 1 3 0 95 0 06 4 3 6025 IC50 0 00025 2 Bliss 法 自己查阅书籍 3 IC50 计算软件 见下面附件 4 自己用 EXCEL 做趋势线来求 IC50 关于 LD50 的方法与此相似 5 在线求 IC50 或 EC50 http chiryo phar nagoya cu ac jp javastat JavaStat j h tm 结果统计学处理 所有数值以 x s 表示 应用 SPSS 软件进行方差分析 p 0 05 时为相差显著 p 0 01 时为 相差非常显著 可以以时间为横轴 光吸收值为纵轴绘制细胞生线 专门公式求 IC50 或 计算抑制率 细胞死亡率 OD 对照组 OD 实验组 OD 对照组 excel 表中可以做两两比较的 T test 这个你可以参考一下 你的数据应该用多个样本均 数的 T test 方差分析也可 用的软件是 SPSS 或者 SAS 孔板的重复利用 培养板要用好的 最好进口板 不好的板或重复利用的板只可做预实验 一般贴壁生长 的细胞用重复利用的培养板效果不是很好 因为培养板表层在生产时涂有一层促进细胞贴 壁的物质 在清洗后多半会失去 悬浮或是半悬浮生长的细胞还可以 建议不要用太多次 即使是进口的板子使用次数也不要超过 3 次 底值最好在测得值的 1 3 一下 强烈建议培养板不要重复使用 1 泡酸是可以 但是泡完酸的板子很不利于细胞的生长 会出现帖壁不好 细胞生长缓慢等情况 2 这样的板子消毒灭菌很不彻底 如果有万一 则因小失大 3 重复用的板子洗不干净在培养过程中易出现杂质 重复利用时重复利用时 做法做法 1 1 洗净后用 2 NaoH 浸泡 4 小时 再用 1 稀盐酸浸泡 4 小时 冲洗 15 遍 蒸馏水冲洗 3 遍 烘干 UV 照射过夜 紫外 2 小时以上消毒即可 做法做法 2 2 泡酸 2 4