酸奶菌种的分离鉴定(课程设计)

课 程 设 计 说 明 书课程名称：新 编 生 物 工 艺 学设计题目：酸奶菌种的分离鉴定 院 系：生物与食品工程学院 学生姓名： 张 明 学 号：200906050046 专业班级：09 生 物 工 程 指导教师： 李 安 华 2012年 5 月 20 日课 程 设 计 任 务 书设计题目酸奶菌种的分离鉴定学生姓名张明所在院系生物院专业、年级、班09生物工程二班设计要求：1、 设计题目选择要求紧扣生物工艺学相关教学内容和生产实际2、 要充分查阅相关背景资料，了解相关内容的前沿进展及存在问题3、 实验方案要切合实际，严密合理4、 设计说明书要求规范，科学。文字要认真斟酌。5、 绘制工艺路线和图纸要符合相关要求。学生应完成的工作：1、查阅相关资料了解酸奶菌种分离的材料仪器等2、做实验进行菌种的分离培养，及提取菌种进行发酵培养3、发酵过程中进行测定及对发酵酸奶进行测定4、整理材料和数据，写课程设计参考阅读文献：1 徐松滨.李威娜 酸奶中保加利亚乳杆菌的分离和鉴定期刊论文 中国农学通报 2003(3)2 黄良昌.吕晓玲.姚秀玲.朱惠丽 保加利亚乳杆菌浓缩培养的研究期刊论文 中国农学通报 2002(1)3 吴宪忠.赵辉. 乳酸菌在酸奶中的应用及研究进展期刊论文 中国农学通报 2007(1)4 凌代文.乳酸细菌分类鉴定及实验方法 期刊论文 微生物学通报 1999(1)5 朱丹宇.王英.周剑忠.黄开红 酸马奶中乳酸菌的分离鉴定及其生物学特性的研究 期刊论文 江苏农业科学 2009(1)工作计划：5、7 动员会，分组认指导老师。5、8 在老师指导下查阅资料，确定题目为酸奶菌种的分离及鉴定。5、9 确定工艺路线或设备改造方案，需要做实验时，确定实验方案。5、10-15 做实验。5、16-17 整理实验数据和实验过程的材料。任务下达日期： 2012 年 5 月 7 日 任务完成日期： 2012 年 5 月 18 日指导教师（签名）： 学生（签名）： 酸奶菌种的分离鉴定摘 要：本实验研究酸奶中菌种的种类，配置BCG培养基（加1.6%的溴甲酚紫的子醇溶液），并利用平板划线法进行酸奶菌种的分离鉴定，观察菌落进行区分菌种，再对菌种进行分离纯化，制备发酵培养基，利用分离的菌种进行酸奶发酵，检测发酵的酸奶和发酵酸奶的的最佳菌种。关键词：酸奶 菌种 分离鉴定 培养基目录1.设计背景及意义11.1 酸奶及乳酸菌的简介11.2 研究的意义22.设计方案32.1 实验材料的准备32.2 牛乳培养基的配制32.3 倒平板、划线法培养菌种32.4 菌种的鉴别32.5 乳酸菌培养基的配制、接种、发酵32.6 发酵酸奶的鉴定32.7 总工艺流程列叙43.实施方案53.1 实验材料的具体实施53.2 BCG牛乳培养基的配制具体实施53.3 倒平板、划线法培养菌种具体实施53.4 菌种的鉴别具体实施63.5 乳酸菌培养基的配制、接种、发酵具体实施63.6 发酵酸奶的鉴定具体实施74. 结果与结论84.1 各菌株凝乳时间比较84.2 各菌株到达发酵终点所用时间的测定84.3 成品理化指标测定94.4各菌株发酵过程中 pH 值变化趋势比较104.5 成品酸奶贮藏过程中 pH 值变化114.6 成品感官指标评定12 4.7结果与讨论分析125. 收获与致谢136. 参考文献147. 附件151，设计背景1.1酸奶及乳酸菌的简介 酸奶是以新鲜的牛奶为原料，经过巴氏杀菌后再向牛奶中添加有益菌（发酵剂），经发酵后，再冷却灌装的一种牛奶制品。目前市场上酸奶制品多以凝固型、搅拌型和添加各种果汁果酱等辅料的果味型为多。酸奶不但保留了牛奶的所有优点，而且某些方面经加工过程还扬长避短，成为更加适合于人类的营养保健品。酸奶好处：一是能将牛奶中的乳糖和蛋白质分解，使人体更易消化和吸收；二是酸奶有促进胃液分泌、提高食欲、加强消化的功效；三是乳酸菌能减少某些致癌物质的产生，因而有防癌作用 ；四是能抑制肠道内腐败菌的繁殖，并减弱腐败菌在肠道内产生的毒素 ；五是有降低胆固醇的作用，特别适宜高血脂的人饮用；六是 含有乳酸菌，所以具有保健作用。乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。凡是能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸菌的细菌统称为乳酸菌。除极少数外，其中绝大部分都是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道中。 乳酸菌的生理作用1防治有些人种普遍患有的乳糖不耐症（喝鲜奶时出现的腹胀、腹泻等症状）。 2促进蛋白质、单糖及钙、镁等营养物质的吸收，产生维生素B族等大量有益物质。 3使肠道菌群的构成发 生有益变化，改善人体胃肠道功能，恢复人体肠道内菌群平衡，形成抗菌生物屏障，维护人体健康。4、抑制腐败菌的繁殖，消解腐败菌产生的毒素，清除肠道垃圾。5抑制胆固醇吸收，降血脂、降血压作用。6免疫调节作用，增强人体免疫力和抵抗力。7抗肿瘤、预防癌症作用。8提高SOD酶活力，消除人体自由基，具抗衰老、延年益寿作用。9有效预防女性泌尿生殖系统细菌感染。主要应用菌种：保加利亚乳杆菌：长杆形，直径1-3um左右,能产生大量的乳酸。酸碱度方面,为耐酸或嗜酸性,因低 pH能防止一些微生物的生长;温度方面,为嗜温至少许嗜热,最适生长温度在37-45之间,对低温非常敏感。 嗜热链球菌：卵圆形，直径0.70.9um，呈对或链状排列，无运动性。为健康人肠道正常菌群，可在人体肠道中生长、繁殖。可直接补充人体正常生理细菌，调整肠道菌群平衡，抑制并清除肠道中对人具有潜在危害的细菌。1.2研究的意义近几年由于广谱和强力的抗菌素的广泛应用，使人体肠道内以乳酸菌为主的益生菌遭受到严重破坏，抵抗力逐步下降，导致疾病越治越多，健康受到极大的威胁。所以，有意增加人体肠道内乳酸菌的数量就显得非常重要。随着人们生活水平的提高和消费观念的转变，在我国生产销售的酸乳及酸乳饮品数量直线上升, 品种花样繁多, 很受消费者的青睐。酸奶是以新鲜牛乳经有效杀菌, 用不同乳酸菌发酵剂制成的乳制品, 味酸甜细腻, 营养丰富, 深受人们喜爱, 专家称它是“21 世纪的绿色食品”, 是一种“ 功能独特的营养品”。它对人体有较多的好处, 可以维持肠道正常菌群平衡, 调节肠道有益菌群到正常水平等。因此，从发酵乳制品中分离性能优良的乳酸菌，制作真正的健康、绿色的食品，对促进我国发酵乳制品工业的发展具有重要的意义。目前市售的各种酸奶制品中, 作为发酵剂的乳酸菌, 通常为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌这两株菌。用嗜热链球菌和保加利亚乳酸杆菌混合培养发酵的乳酸饮品能补充人体肠道内的有益菌，维持肠道的微生态平衡，且含有易于吸收的营养素，具有抑制腐败菌、提高消化率、防癌及预防一些传染病等功效，并能为食品提供芳香风味，使食品拥有良好的质地。本研究对市售花花牛酸奶（郑州产）中乳酸菌进行了分离鉴定，并进一步探讨制备酸奶条件（温度、时间等），以达到最佳的天然酸奶质量效果，为广大消费者选购高品质酸奶提供理论支撑。2. 设计方案2.1 实验材料准备提前查阅资料准备好实验所需仪器以及实验过程中需要用到的试剂，特别买最近出产的花花牛酸奶。2.2 BCG培养基的配制A溶液：脱脂乳粉100g,水500ml，加入1.6%溴甲苯酚绿（BCG）乙醇溶液1ml，80灭菌20min。B溶液：酵母膏10g，水500ml，琼脂20g，PH6.8，121湿热灭菌20min。以灭菌操作趁热将A溶液和B溶液混合均匀2.3 倒平板、划线法培养菌种将BCG培养基倒平板，将酸奶稀释成不同梯度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5）进行划线培养，然后放入40培养箱中培养48h，观察。2.4 菌种的鉴别(1)配制脱脂乳试管培养基，分装试管，包扎，灭菌备用。(2)选取经初步鉴定的乳酸菌典型菌落，用接种环挑取转至脱脂乳试管中，40培养箱中培养824h。观察。2.5 乳酸菌培养基的配制、接种、发酵(1)乳酸菌培养基的制作将脱脂乳和水以1:7（W/V）的比例，同时加入6%的蔗糖，充分混合，于8085灭菌1015min，冷却至3540，作为制作饮料的培养基质。即脱脂乳14.3g，无菌水100ml，蔗糖6g。(2)接种以不同的菌种混合作为发酵剂接种培养基进行发酵。(3)发酵将接种后的酸乳瓶置30，36和42培养箱中培养2或4h时。培养时注意观察，出现凝乳后停止培养。然后转入45冰箱中冷藏24h以上。2.6 发酵酸奶的鉴定（1）对酸奶品质鉴定（2）对酸奶数据指标的测定2.7 总工艺流程列叙工艺流程：试验材料的准备-BCG培养基的制备-倒平板-酸奶的稀释-划线分离-恒温培养-菌种的鉴别-对菌种传代提纯-发酵培养基的制备-混合发酵剂接种-恒温发酵-对酸奶的鉴定-整体实验的总结3 实施方案3.1 实验器材(1)菌种：新鲜乳酸饮料(花花牛乳；含保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌)。(2)试剂：脱脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄)、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙；0.4gNaOH固体、4.2ml浓HCL(分析纯) 、20gCaCO3固体、酵母膏20g 、琼脂30g香柏油、脱脂奶粉100g 、蔗糖10g；(3)仪器：高压蒸汽灭菌锅、恒压干热灭菌箱、超净工作台、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿、试管、300ml三角瓶、移液管、天平、牛角匙、电炉、量筒、漏斗、漏斗架、玻璃棒、棉塞、吸管、线绳、标签、500ml锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯、酒精灯、石棉网、接种针（环）、擦镜纸3.2 培养基的配制配制BCG牛乳培养基，分装三角瓶，包扎，灭菌备用。BCG牛乳培养基配制：A溶液：脱脂乳粉100g,水500ml，加入1.6%溴甲苯酚绿(BCG)乙醇溶液1ml，80灭菌20min。（1.6%溴甲苯酚绿(BCG)乙醇溶液用1.6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中，再加水至100ml制成）B溶液：酵母膏10g，水500ml，琼脂20g，PH6.8，121湿热灭菌20min。以灭菌操作趁热将A溶液和B溶液混合均匀3.3 倒平板、划线法培养菌种3.3.1倒培养基 在无菌室，先用紫外线照射半小时把表面菌灭了，在通风10min后，每培养皿倾注约15ml左右已溶化的BCG牛乳培养基，立即放在桌上摇匀，冷却凝固后即成平板。 3.3.2十倍稀释法将检样充分摇匀后，用十倍稀释法稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5各种稀释度的样品液。目的是为了确定哪个稀释度最适宜。一般在培养基上长处50-300个菌落的稀释度为最佳。3.3.3 培养在BCG牛乳培养基琼脂平板上划线分离，每稀释度做两个平皿。置40培养箱中培养48h。如出现圆形稍扁平的黄色菌落及周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。3.4 菌种的鉴别(1)观察菌落大概判定是哪种菌种嗜热链球菌：菌落适中，多为乳白色，表面光滑、湿润，中间凸起，边缘不整齐。显微镜观察菌的形态呈椭球形或者圆形，大部分连在一起形成链状。保加利亚菌：菌落较大，不光滑，通常为无色到淡白色，透明，不光滑，直径1mm-3mm，镜检为杆状，不运动。用革兰氏染色进行观察，分离菌株。(2)配制脱脂乳试管培养基，分装试管，包扎，灭菌备用。脱脂乳试管培养基成分：20g脱脂奶粉，285ml灭菌水。配制好的脱脂乳培养基。(3) 选取经初步鉴定的乳酸菌典型菌落，用接种环挑取转至脱脂乳试管中，40培养箱中培养824h。若牛乳出现凝固，无汽泡，呈酸性，涂片镜检细胞为杆状或链球状，革兰氏染色显阳性，则可将其连续传代46次，最终选择出在36h能凝固的牛乳管，作菌种待用。3.5 乳酸菌培养基的配制、接种、发酵(1) 乳酸菌培养基的制作将脱脂乳和水以1:7（W/V）的比例，同时加入6%的蔗糖，充分混合，于8085灭菌1015min，冷却至3540，作为制作饮料的培养基质。即脱脂乳14.3g，无菌水100ml，蔗糖6g。(2)接种将纯种嗜热乳酸链球菌、保加利亚乳酸杆菌及两种等量混合菌液作为发酵菌剂，均以25%的接种量分别接入培养基质中即为饮料发酵液。接种后摇匀，分装到已灭菌的酸乳瓶中，每一种菌的发酵液重复分装4瓶，将瓶盖拧紧密封。(3)发酵将接种后的酸乳瓶置38培养箱中培养2或4h时。培养时注意观察，出现凝乳后停止培养。然后转入45冰箱中冷藏24h以上。经此后熟阶段，达到酸度适中（pH44.5）,凝块均匀致密,无乳清晰出,无汽泡,获得较好口感和特有风味。3.6 酸奶发酵性能的鉴定根据国标及文献报道，凝乳时间、达到发酵终点时间、发酵过程中的pH值变化及成品理化指标、感官指标(色泽、气味、滋味、组织状态、黏稠度、爽滑感、颗粒感、涩感)及成品酸奶贮藏过程中 pH值的变化是反映菌种发酵性能的重要指标。因此，本研究将对以上几个指标进行研究测定，来研究各个菌种的发酵性能.4、 结果与讨论经过实验记录，所得结果如下:4.1 各菌株凝乳时间比较将接种后的酸乳瓶放置在恒温箱里培养，注意观察各个瓶中出现凝乳现象的时间并记录，如图4.1：从上图可以看出，混合菌的凝乳时间比单一菌种凝乳时间短得多。 4.2 各菌株到达发酵终点所用时间的测定接种发酵两个小时后，用pH酸度计每隔一段时间测量发酵液的酸度，直到发酵液酸度不再发生改变或者改变很微小时，记录发酵所用时间。如图4.2： 从图4.2中可以看出，混合菌的发酵到达终点时间明显小于单菌种的发酵到达终点的时间。4.3 成品理化指标测定用酸度计测量发酵好的的酸奶的酸度，做记录，如图4.3： 从图4.3中可以看出，混合菌的发酵的酸奶酸度明显大于单菌种的发酵的酸奶的酸度。4.4, 各菌株发酵过程中 pH 值变化趋势比较利用pH酸度计在发酵的过程中定时对发酵液进行测定，记录数据，如图4.4.1,4.4.2，4.4.3： 从图4.4.1,4.4.2,4.4.3中可以看出混合菌的发酵的整个过程中pH值最低，所以混合菌发酵的酸奶酸品质比较好。4.5 成品酸奶贮藏过程中 pH值变化同样利用pH酸度计每隔十个小时对储藏的酸奶进行测量，记录数据，如图4.5.1,4.5.2,4.5.3,4.5.4： 从图4.5.1,4.5.2,4.5.3,4.5.4中可以看出，混合菌在储藏的整个过程中其pH值明显比单菌种的要低，说明混合菌发酵的酸奶质量要比单菌种发酵的酸奶质量高。4.6 成品感官指标评定样品色泽气味滋味状态粘稠度爽滑感颗粒感涩感总分1杆菌191313221011-3-3822杆菌191313231112-3-2843杆菌191414231112-2-3884杆菌191515241112-3-2901球菌19131321911-3-2802球菌191212231010-2-3813球菌191313241110-3-3824球菌191414231111-2-2871混合191616241012-2-2912混合191414241112-2-2903混合191515251112-2-2934混合191616261112-2-297注释:色泽，气味，滋味满分分别为20分，状态为30分，粘稠度，爽滑感分别15分，颗粒和涩感最高为扣10分。总分味酸奶总的质量评价。4.7 结果与讨论分析：经以上数据对比，混合菌发酵的酸奶酸度高，ph值低，发酵时间短，口感最好。所以用混合菌发酵最适宜。讨论与分析：(1)菌种的分离鉴定的方法：利用BCG牛乳培养基培养（含溴甲苯紫的乙醇溶液），菌种呈黄色的为乳酸菌，很容易与不产酸的杂菌分开，提高了分离效率，再利用菌落的形态特征区分出保加利亚菌和嗜热链球菌，利用革兰氏镜检就更容易区分出菌种。(2)菌种的发酵及性能鉴定：将发酵菌种分为三种，即保加利亚菌，嗜热链球菌和混合菌，查看三者的性能对比。记录发酵酸奶的ph值，发酵时间，发酵的质量等进行对比，能正确的对比出发酵性能高低。(3)有关菌落的多样性：在观察菌落生长的过程中，培养基上出现其他杂菌，可能是操作的过程中被杂菌污染或者乳酸菌种的变异。5.收获和感谢经过两周的实验和之前的选题与最后的课程设计撰写，本课题最终形成了定稿。在这样的