【毕业学位论文】（Word原稿）喹烯酮残留标示物的ELISA检测方法研究及半抗原设计与合成 -基础兽医学硕士论文

I 密级： 论文编号： 硕士 学位论文 喹烯酮 残留标示物 的 测方法研究及 半抗原设计 与合成 I 要 我国自主研制的喹噁啉类新兽药 喹烯酮 ， 具有 毒性小 、 活性高的优点， 属高效、安全的饲料添加剂，但 因 作为兽药使用，仍需考虑其通过食物链作用对人体产生 的 不良影响，故也需建立该化合物在动物可食用组织中残留的快速、灵敏的检测方法。本论文通过 抗原和抗体的制备及半抗原的改造，进行了在动物可食用组织中 喹烯酮 残留的 速检测的方法学研究。 本论文研究首先以邻硝基苯胺为起始原料，经四步反应 获得了 高 纯度的 残留标示物 3啉 。 并利用 其分子结构中已有的羧 基为偶联位点，以碳二亚胺法和蛋白进行偶联，完成了两种偶联物的制备（ 经紫外光谱法鉴定偶联成功。以两种偶联物为不同免疫原、采用不同的免疫时间间隔免疫新西兰大白兔，获得多克隆抗体， 抗体 效价测定和特异性鉴定 的 实验结果表明：两种免疫原均能产生高 效价的抗体，免疫间隔延长有利于效价提高，且以 载体有利于避免针对蛋白载体的抗体产生。但间接竞争性 对抗体的灵敏度测定结果表明 ， 较高，不 能 满足残留检测的要求。 本论文认为 导致 测灵敏度较低的原因，是 残留标示物 和蛋白偶联后的特征结构发生改变，诱导产生的抗体不能够对游离 好的识别，因此，本论文设计了能够最大化保留构特征的系列半抗原结构，并对其合成路线进行了筛选和优化，最终以对甲基邻硝基苯胺为起始原料，经氧化环化、溴代、水解、 合、还原、水解六步反应 制备含羟甲基结构的 生物 73喹噁啉 为 制备 对游离残留标示物高亲和力的抗体 ，高灵敏度的 留检测 方法的建立 奠定 基础 。 关键 词： 喹烯酮 ， 抗体 ， 半抗原 ， 化学合成 is a of is as a as an be an to of in be In we a of to a s in In we as it of in by by as by by SA as of of to of to we in by in we as as V 目 录 第一章 绪论 . 1 药残留研究的意义及现状 . 1 噁啉类药物物的残留毒性及残留检测进展 . 2 噁啉类药物的残留毒性 . 2 噁啉类药物的残留检测进展 . 3 疫分析在残留检测中的应用 . 4 分子药物半抗原设计与合成研究进展 . 4 抗原的设计原则 . 5 接臂的引入 . 5 性基团的引入 . 6 用异质半抗原 . 7 研究内容与目的 . 9 第二章 测方法的初步研究 . 11 验仪器与材料 . 11 品与试剂 . 11 要仪器 . 11 验动物 . 11 验方法 . 12 原制备 . 12 体制备及质量评价 . 14 测灵敏度的测定 . 15 验结果 . 16 原的鉴定 . 16 体制备及质量评价 . 18 测灵敏度的测定 . 19 析讨论 . 20 原制备 . 20 体制备 . 21 测灵敏度的测定 . 21 第三章 半抗原的设计与合成 . 23 抗原设计 . 23 抗原结构设计 . 23 抗原合成路线选择 . 24 抗原合成 . 25 验仪器与材料 . 25 验方法 . 26 果与讨论 . 28 V 第四章 全文结论 . 31 参考文献 . 32 附 录 原始图谱索引 . 35 附图一 3喹噁啉 1,4电喷雾电离质谱 . 36 附图二 3喹噁啉 电喷雾电离质谱质谱 . 37 附图三 3喹噁啉 电喷雾电离质谱质谱 . 38 附图四 3喹噁啉 核磁共振氢谱 . 39 附图五 5核磁共振氢谱 . 40 附图六 5核磁共振氢谱 . 41 附图七 73喹噁啉 1,4红外图谱 . 42 附图八 73喹噁啉 1,4电喷雾电离质谱质谱 . 43 附图九 73喹噁啉 1,4核磁共振氢谱 . 44 附图十 73喹噁啉 红外图谱 . 45 附图十一 73喹噁啉 电喷雾电离质谱质谱 . 46 附图十二 73喹噁啉 红外图谱 . 47 附图十三 73喹噁啉 电喷雾电离质谱质谱 . 48 附图十四 73喹噁啉 核磁共振氢谱 . 49 致谢 . 50 作者简介 . 51 国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 药残留 研究的意义及 现状 由于 兽药（包括药物添加剂） 在畜牧业中的应用日益广泛，药物在动物体内的滞留或蓄积而引起食品中药物残留问题已相当普遍。 兽药残留 (指给动物使用药物后蓄积或贮存在细胞、组织或器官内的药物原 型 、代谢产物和药物杂质。在畜牧业生产中广泛使用的亚治疗剂量药物、 非法使用禁用兽药及其它化合物、不遵 守休药期的规定、违背有关标签的规定是导致兽药残留超标的主要原因 （ 张宏伟 ,2004） 。 兽药残留在国内外已成为一个影响广泛且颇具争议的问题，其与公众的健康息息相关。对残留的监测与控制已经是目前国内外兽药研究、开发、使用和管理中的重要内容。 尤其我国加入 来，长期制约我国畜禽产品出口的关税壁垒已被打破，而所谓“绿色贸易壁垒”将成为制约我国畜禽产品出口的主要因素，因此加强 对食品中药物 残留的监控 对提高我国的公共卫生水平 、食品安全以及 畜禽产品的国际竞争力均具有重要意义。 兽药残留分析技术是复杂混合物中的痕量分析技术 , 其特殊性和复杂性在于痕量、动态的待测物存在于复杂的生物样品中，分析手段需要与兽药的理化性质、体内过程、存在状态以及药理毒理相结合。 残留分析既需要精细的微量操作手段 ， 又需要高灵敏的痕量检测技术 ， 分析质量控制和分析策略 (如筛选性分析、确证性分析 )也 有特殊要求 （ et 1983） 。 兽药 的 残留分析 最初 仅限于化学分析法、比色法和微生物法 , 化学分析法和比色法缺乏专一性和敏感性 , 而微生物法虽然普遍适用于抗菌药物的残留测定 , 但不易筛选到特别敏感的菌株 , 方法常受到其它抗菌药物的影响。薄层色谱 (出现使分析方法有所改进 , 但仍需要复杂的样品前处理 , 且 灵敏度不高。 20 世纪 60 年代后的气相色谱 ( 70、 80 年代后的高效液相色谱(及 S、 S 等联用技术的飞速发展大大地提高了分析的灵敏度和分辨率 , 尤其通过联用技术可提供待测残留组分的结构信息或对未知残留组分进行结构鉴定，而大大 拓宽了残留分析范围 。 虽然 仪器分析方法 具有无与伦比的灵敏度和分辨率， 但其 设备昂贵 、 对实验人员要求 较高、 分析费时 、 复杂烦琐的样品前处理 过程和难以进行 同时 大量样品的 筛选 的缺点 ， 对药物残留的及时监控无疑是不适的。 而 九十年代免疫检测技术 (借其特异性高、简单、灵敏、快速的特点而在兽药残留检测领域得以飞速发展， 一系列免疫检测试剂盒的生产与应用加快了兽药残留分析的标准化 （ 蔡勤仁， 2002） 。 美国化学会 (将免疫分析与气相色谱、液相色谱同列为残留 检测 的三大支柱技术。美国环境保护署 (美国农业部食品安全检验司 (美国化学会制定了农药残留免疫检验商品试剂盒评定和认可的建议准测（ et 995; 陈新建 ， 1998） 明确了测定结果的法 律效应。 现在及将来相当长时期内 ， 色谱法 、 光谱法及其联用技术仍是兽药残留分析技术的主流 ， 并围绕高分辨 (分离 )和高灵敏两大精髓发展 ， 以期能简化分析过程 ， 提高分析效能 ， 特别是多残留分析能力和分析过程自动化智能化。 与此同时，以酶联免疫吸附检测法（ 代表的免疫分析方法也将会 凭借其 特异性强、灵敏性高、样品通量大、检测迅速、检测费用低廉等优势 在兽中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 2 药残留监控和快速残留 筛选过程中发挥更大的作用。 噁啉类 药物 物 的残留毒性 及 残留检测进展 噁啉类 药 物 的残留毒性 喹噁啉类化合物（ 一类通过 1,4目前我国使用量最大的饲料添加剂之一。主要包括：喹乙醇 （ 卡巴氧 （ 、 乙酰甲喹 （ 、喹 烯酮 （ 等，它们均具有提高饲料效率、促进动物生长和广谱抗菌的作用。抗菌活性是促生长作用的基础 ， 而且它们的抗菌机理相同 ， 都是 通过 抑制 细菌 成 （ 曹随忠 ， 2001） 。其中喹乙醇 和卡巴氧是该类药物的代表药物，因具有良好的广谱抗菌效果和促生长作用 ，而被广泛应用于养殖业中。喹烯酮 是 我国研制开发的一类新兽药 ， 喹烯酮与喹乙醇等相比具有高效、安全、添加量少等优点 ,并 可明显提高畜禽繁殖率及幼仔畜禽的存活率。 图 1噁啉类药物 结构式 实际生产中，因 超剂量使用或饲喂时间过长等原因 ， 通常会引起 喹噁啉类 药物 在动物可食用组织中有一定的残留 ， 有时甚至会导致残留量超标 。 验、体外诱变哺乳动物细胞实验、哺乳动物体内诱变实验均证明 喹乙醇和卡巴 氧 对啮齿类动物表现出基因毒性和致癌性 （ et 2002; et 981;1984） ， 使用穿梭质粒 /哺乳动物细胞检测系统在喹乙醇诱变分子机制研究中发现，喹乙醇引起质粒靶基因核苷酸序列改变主要表现为点突变和连续缺失 （郝利华 ， 2006） ，此外还有过喹乙醇引发饲养场工人发生过敏和光敏感性皮炎的报道（ . et 002） 。 喹烯酮具有同样的防病和促生长作用，但 毒性 和致癌性 却 明显 低 于喹3 C 2O 333 H C O O C 醇乙 酰 甲 喹喹 烯 酮 卡 巴 氧中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 3 乙醇和 卡巴氧 （ 王玉春 ， 1995； 王玉春 ， 1993； 严相林， 1998） 。 噁啉类 药 物 的残留 检测进展 由于 喹噁啉类药物 其良好的抗菌促生长效果， 该 类药物 在许多国家仍然被作为饲料添加剂而广泛使用，为防止食品中残留的药物通过环境或食物链对人体健康造成影响，各个国家和组织对该类 药物 休药期 的时间、残留标示物的选择和最高 残留限量都有严格的规定。 有研究结果表明，喹噁啉类具有喹噁啉类 动物体内易发生初级代谢，生成脱氧化合物，进而发生次级代谢，生成 喹噁啉 巴氧）和 3喹噁啉乙 醇） （ et 990）， 世界卫生组织和世界粮农组织已经确定喹乙醇和卡巴氧的残留标示物分别为 3喹噁啉 和 喹噁啉 990）。喹烯酮毒理学研究表明该化合物毒性较小， 属 高效、安全的饲料添加剂，但该药物 作为兽药使用，仍需考虑其通过食物链作用对人体产生不良影响，故也需要建立其食用动物组织残留量监测方法并进一步确定其残留限量，喹烯酮具有 同 喹乙醇类似的结构母核，可能在动物体内发生类似的代谢反应，生成相同的 代谢产物，因此有研究者将 3喹噁啉 为主要检测对象 （黄玲莉， 2005） ，并在 饲喂过喹烯酮的 动物组织中检测到其存在 ， 尤其在 停药后，肝脏中仍然能检测到 3喹噁啉 存在， 因此， 有研究者认为 3喹噁啉 以 对该药物的残留进行监控。 欧盟委员会认为喹乙醇的休药期不能确定 , 其对人体健康存在可能的不良作用 , 于 1999 年 1月 1 日正式禁止喹乙醇用作促生长添加剂（ 998）。 我国 目前批准使用的喹噁啉类的药物有喹乙醇、乙酰甲喹、喹烯酮，其中 对喹乙醇的休药期规定为 35天，其残留限量根据 农业部 2002年颁布的动物性食品中兽药最高残留限量的要求，对喹乙醇的残留检测以 其代谢产物 3喹噁啉 规定 在猪肌肉中的 最高残留限量为4g/肝脏中 的 最高残留限量为 50g/农业部畜牧兽医局 ， 2002） 。 目前，针对 喹噁啉类药物 残留 检测方法多为 ， 并且研究的热点主要集中在喹乙醇和卡巴氧这两种药物上。 由于喹乙醇 和卡巴氧 的残留标示物的标准品 不易 获得，我国对喹乙醇的残留检测曾多为其原型药物， 1993 年 制定 的 中华人民共和国 出口肉中喹乙醇 和卡巴氧 残留检测的行业标准 （ 商务部， 1993） ,标准规定了出口肉中喹乙醇 和卡巴氧 残留量检验的抽样、制样和液相色谱测定方法。标准适用于出口鸡肉、猪肉、羊肉、兔肉中喹乙醇 和卡巴氧 原型药物 残留量的检验 ，该方法的 最低检测限为 50g/ 20添加浓度下，回收率在 80 间 。使用 S 联用方法 对猪肝脏中喹乙醇的残留标示物 3喹恶啉 最低检测限（ 低定量限 （ 篇文献同时也报道了对同属喹噁啉类药物的卡巴氧的残留检测方法，对卡巴氧的残留标示物 喹噁啉 et 2005） 。 黄玲莉 等 使用 对喹烯酮在鸡和猪的可食用组织中 3喹恶啉 残留检测方法进行了建立， 最低检测限 为 25g/低定量限为 50g/玲莉，2005） 。 迄今为止，国内外尚无使用免疫分析 方法 法对 喹噁啉 类药物在动物组织中 的 残留进行检测的中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 4 报道，仅 方法对饲料中喹乙醇 原型药物 的含量进行过检测，使用该方法检测饲料中喹乙醇的最低检测限为 低定量限为 4-8 mg/加浓度 范围内回收率在 91间，并且交叉反应率试验表明针对喹乙醇的多克隆抗体对结构类似的同类药物卡巴氧具有 叉反应率 （ et 2005） 。 虽然 报道的方法完全可以满足饲料 中喹乙醇含量检测的要求，但仅从检测灵敏度上看，对于残留检测的要求还有 数个数量级 差距 。 因此，对 喹噁啉 化合物 这一 类 使用量巨大 ，列入欧盟重点监控的违禁药物，有必要建立对其残留进行快速、灵敏、高通量检测的 测方法。 疫分析在残留检测中的应用 免疫分析技术 (以抗原和抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析技术，抗原抗体的初级结合反应遵守质量作用定律，可用 程来描述，所以，也有学者认为免疫分析不属于生物测定的范畴，而是使用生物材料作为试剂的理化分析技术。 于 1959 年创立的放射性免疫分析方法 (公认为有机痕量分析的重大突破，因此获得了 1977 年诺贝尔生物医学奖 （陈新建， 1998） 。随后相继发展起来的酶免疫分析法 ( 蔡勤仁 , 2002） 、荧光免疫分析法 ( et 1997） 和化学发光免疫分析法 (韩鹤友 ,2005） 等免疫学分析方法，凭借其高灵敏性、高特异性、样品通量大、检测迅速、成本低廉的特点，在食品中兽药农药残留分析、环境污染物检测等领域得到广泛的应用。 免疫反应涉及抗原抗体分子间的立体化学、电荷、氢键和偶极 间的综合作用，因而具有高度的选择性，免疫分析法中应用最为广泛的是酶联免疫吸附检测（ 将免疫反应的高选择性和酶促反应的级联放大作用相结合，具有 极高的 选择性和灵敏度，在诸如药物残留分析等复杂基质中痕量组分的检测发挥着越来越大的作用。现在几乎所有重要的兽药都已经建立或正试图建立酶联免疫法的残留测定方法，如 et 2005） 、喹诺酮类 （ et 2001） 、磺胺类 （ 刘智宏 ,1997） 、阿维菌素类 （ 李俊锁， 1997） 等药物的 速检测 方法 均以研制成功。 分子 药物 半抗原 设计与合成 研究进展 抗体作为各种免疫分析的核心试剂，对免疫分析的灵敏度、特异性等起着至关重要的作用，因此高亲和力抗体的制备是免疫分析方法建立的关键环节。 大多数 兽药 、毒素、环境污染物分子质量小于 1000u，属于仅有反应原性而无免疫原性的半抗原，目前制备小分子半抗原的抗体的常规方法为：选择具有毒理学意义的代谢产物或原 型 药物作为待测物，设计合成保留待测物分子结构特征并带有活性基团的半抗原，通过共价键使半抗原与大分子质量蛋白质载体偶联，制备人工免疫原，经动物免疫程序制备针对半抗原的特异性抗体 。 但对于分子质量较小的半抗原，尤其分子质量小于 300 u 的半抗原，有时难以获得针对药物中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 5 小分子的高亲和力抗体，有多篇文献对小分子半抗原不利于诱导抗体产生的因素进行过研究和综述 （ et 1994; et 1991; et 1994; et 2000; et 1994） ， 曾对分子质量在 111 到 1202u 的半抗原诱导产生抗体的亲和系数 (过研究，结果表明分子质量在 334 到 374u 的半抗原诱导产生的抗体仍能具有较高的亲和系数，但对于分子质量低于 300u 的半抗原，获得高亲和力抗体的可能性将显著下降，从而导致以竞争性酶联免疫吸附测定（ 代表的竞争性免疫分析方法灵敏度的下降 （ et 1994） 。 针对由于抗体对小分子半抗原亲和力较低而导致检测灵敏度下降这一问题， 国内外研究工作者 做了 大量的探索和研究， 许多新型检测模式和级联放大系统近年来不断被孕育而生，使免疫分析所能达到的灵敏度显著提高 （杨唐斌， 2005） ，但 同时也对检测条件和所需检测设备提出了更高的要 求。因此，许多研究者的注意力已转移到通过 半抗原设计与合成 来切实提高抗体对待测物的亲和力上来。如 提出 的 利用“位阻效应”的半抗原设计理念 颇具指导意义 ， 通过 在人工免疫原的半抗原中合理引入不同程度的空间位阻，诱导产生的多克隆抗体可以对一系列同系物中不同大小的分子选择性的识别 （ et 1998） 。 下文对近年来 有关 半抗原设计与合成的研究进展作一简要综述。 抗原的设计原则 半抗原设计的目的为使半抗原刺激机体产生特异性免疫应答，并获得对待测物分子具有高亲和力的抗体。 认为在半抗原的设计中须遵循以下原则：（ 1）免疫原中的半抗原应在分子结构、立体化学和电子分布上与待测物分子尽可能的相似；（ 2）半抗原结构中的连接臂应不易于诱导产生 “臂抗体 ”，最好使用一定长度的碳链；（ 3）半抗原分子应具有便于与蛋白载体偶联的活性基团（如 ），且活性基团的存在对待测物分子的电子分布应没有影响；（ 4）半抗原与蛋白偶联后仍应保留待测物分子的基本结构 （ et 1998） 。因此，半抗原设计的关键在于：尽可能的保留原待测物特征结构，并在适当的位置 引入合适的连接臂和与蛋白载体偶联活性基团 （ 周思祥 ， 2005） 。 接臂的引入 为突出待测物分子的特征结构 , 半抗原设计时常在特征结构和载体蛋白之间引入一定长度的连接分子 ,即连接臂。引入连接臂是半抗原抗体制备时较为常用的方案，如 在小分子半抗原 33抗体制备时发现，当使用较短的连接臂或不使用连接臂时不能诱导产生针对半抗原的抗体，而具有较长连接臂的半抗原却能诱导产生针对半抗原的抗体（ et 2000） 。人们对这种现象的解释是 ：当连接臂较短或没有连接臂时，半抗原有可能被载体蛋白的三维结构掩盖，而当连接臂足够长时，有利于小分子半抗原充分暴露于载体蛋白的表面，便于抗原提呈细胞（ 其的识别。通常认为连接臂的长度最适在 3 6 个碳原子之间，连接臂太短不利于半抗原的充分暴露，而连接臂太长又会因疏水作用而造成烷基链的折叠，导致半抗原分子仍然被载体蛋白所掩盖，也不利于抗原提呈细胞的识别 （ et 1989） 。但是有研究结果对连接臂有利于诱导抗体产生这一观点提出了质疑，如 发现氨基甲酸酯类中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 6 农药残杀威（ 半抗原连接臂长度在 2 5 个碳原子时，获得的抗体效价没有显著性差异 （ et 2001） 。同样 在有机磷农药倍硫磷（ 免疫分析检测方法建立过程中，发现使用连接臂长度在 2 6 个 C 原子时制备的抗体效价无显著性差异，而且具有不同长度连接臂的免疫原制备的多克隆抗体和具有不同长度连接臂的包被原两两组合建立的间接竞争测模式之间检测灵敏度也没有显著差别 （ et 2003） 。然而 发现制备免疫原和包被原时使用不同结构的连接臂、采用不同的偶联方法 或改变连接臂的引入位置可以大大提高测的灵敏度 （ et 2003） 。 我国研究工作者也在连接臂的引入方面做了大量探索，沈建忠等在对马度霉素的酶联免疫检测方法建立过程中，在制备免疫原时以半抗原的羧基为活性位点与载体蛋白的氨基偶联，而包被原的制备则使用引入带有氨基连接臂半抗原与载体蛋白的羧基偶联，通过改变半抗原与免疫原和包被原的键合方式，使检测灵敏度提高 两 到 三 倍 （ 沈建忠 ，1999） 。因此，对于一个待测物进行半抗原设计时，应对连接臂的长度、结构以及引入位置进行全面的考察和比较。 性 基团 的 引入 活性基团的引入有两种方式：第一种是利用待测物上已有的活性基团（ H、卤素等），通过双功能试剂（如 H2)H2)珀酸酐、戊二醛等）引入连接臂和活性基团，使之与载体蛋白偶联，具体实施方法许多专著皆有详尽介绍 （ 杨利国 ，1998；