【毕业学位论文】（Word原稿）β-氨基丁酸诱导番茄根部基因的表达及其功能初步分析-分子植物病理学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 基因的表达及其功能初步分析 of of in .) of of in .) I 摘要 近 20 年来，随着设施蔬菜栽培在我国的迅速发展，番茄根结线虫的发生区域不断扩大（如在辽 宁省沈阳市郊区露地已发生北方根结线虫病），危害日趋严重，其 产量损失达 30 50，严重的 50以上。 由于缺乏番茄高抗 根结 线虫的品种，生产上主要采用甲基溴土壤熏蒸或高毒、高残留化学杀线剂防治线虫的危害，对产品和环境均造成严重的污染 ， 根结线虫的危害已成为制约我国无公害番茄生产可持续发展的突出问题， 亟待研究开发可持续、环保型控制技术。近年来研究表明， 有高效的诱导抗病作用，在抗线虫方面，已有多篇文章报道了 有诱导农作物或蔬菜防御线虫病效力，但有关 导植物抗线虫的作用机理还 不清楚，若能从基因表达调控的角度研究分析植物应答 导的分子机制，则有助于认识 诱导抗病作用，为开发利用 导植物抗病潜能，创新有害生物综合治理途径与技术奠定理论基础。 本研究以番茄为材料，利用 一基因转录谱分析技术研究番茄根部组织应答导后基因转录谱 。 从显示出的约 5000 个转录基因片断（ ，发现了 23 个转录上调基因片段， 6 个转录下调基因片断。经过克隆测序，最终获得了 12 个 导上调基 因片断的序列，其中有 3 个差异明显的 序列长度一致，序列同源性达 99。用 此序列进行表达分析， 结果显示此序列确是 导特异性基因，水处理不能诱导该基因表达，而 大量诱导其表达。对此序列进行 终获得部分 3列。在此基础上，利用 公共数据库进行生物信息学分析和功能预测。 研究结果表明： 导植物根部抗病机制涉及植物多方面生理生化反应，多个功能不同基因参与控制。本研究所得的 10 个基因片断经过生物信息学分析和功能预测 ,相 当一部分序列的同源基因是植物体在抗病、抗逆反应中的表达标签序列，根据功能可将其分为五类。第一类是防御反应基因， 3， 4 预测为病程相关蛋白基因 族成员，它们具有蛋白水解酶功能，所占比例 20；第二类是转运蛋白基因， ， 、 6、 17， ，负责细胞内外离子、水和小分子物质的跨膜运输，所占比例 30；第三类是信号传导蛋白， ，绑定蛋白，它结合游离 是 信号传导途径上重要的功能蛋白，所占比例 10；第四类，分子伴侣蛋白 助蛋白 质的复性，所占比例 10；第五类即功能未知基因， 1、 12，所占比例 30。 以 列为基础，用 法，得到部分 列，长度为 962析显示此基因可能是 运 因（质膜型）， 在茄科类植物中此序列没有同源序列，可能是首次发现的茄科植物质膜型 运 因。 关键词： 番茄， 诱导抗病性 of of 0 to an a of in in of so at If on at of of be be to is of to ) ,000 23 By 2 of 9%. of a 3of of by in A of in to to of 0 be as R), 14 of a PR 69. , 3, 6, 17, 4 to of 2O, is to a is an of no to 11, 12. we 962DD is in no M in 录 摘要 . I . 录 . 略词表 . 一章 文献综述 . 1 1 导植物抗病作用的研究进展 . 1 植物的诱导抗病作用 . 1 使用方法及在植株体内的吸收、运转和代谢 . 4 导植物抗病的生理、生化作用机制 . 5 构与功能的关系 . 8 用前景及展望 . 8 2 术及其研究进展 . 9 2.1 术的基本原理 . 9 主要过程 . 10 2.3 术的特点评价 . 12 2.4 术的应用现状 . 12 第二章 实验设计 . 13 1 立题意义 . 13 2 技术路线 . 14 第三章 材料与方法 . 15 1 供试材料 . 15 物材料 . 15 要生化试剂 . 15 2 实验设计与方法 . 15 导处理 . 15 取 . 16 合成 . 16 2.4 . 18 别表达片断回收、克隆 与测序 . 21 关 定量 证 . 22 得全长 . 26 物信息学分析 . 29 第四章 结果与分析 . 30 1 植物的培育 . 30 V 2 提取 . 30 3 双链 合成、酶切连接和预扩增结果 . 30 4 录图谱 . 31 5 受 导转录上调基因片段 分析 . 33 序列测定 . 33 列同源性分析 . 34 列的表达模式 . 36 6 受 导转录下调基因片段的分析 . 37 7 相关序列的 析 . 37 8 验克隆基因全长 . 38 增实验 . 38 列分析 . 39 第五章 讨论 . 44 1 术的利用 . 44 2 序列 导抗病性 . 44 3 对 导植物根部抗病分子机理的探讨 . 46 结论 . 49 展望 . 50 参考文献 . 51 附录 . 57 附录 A: 养基配方 . 57 附录 B： 列 . 57 致谢 . 60 略词表 T: 乙烯（ A：茉莉酸（ 光密度值（ 程相关 （ of NA 分钟转数（ A ：水杨酸（ 国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 1 导植物抗病作用的研究进展 从经暴晒的番茄根系中分离得到的一种次生代谢非蛋白氨基酸。1960年， 抗性（ J P, et 1960），随后 又观察到 有高效诱导豌豆抗黑根病（ 的活性，其诱抗效果高于 C, et 1963)；进一步研究还发现 诱导多种作物产生对多种病害的抗性。近年来利用拟南芥突变体作为试验材料开展 导植物抗病性的研究，越来越显示出 为一种高效、广谱的非蛋白氨基酸植物诱抗剂的潜能，成为人们注视的焦点。本文主要介绍 氨基酸生物农药的研制和开发利用提供依据。 图 1 它的两个同分异购体 植物的诱导抗病作用 广谱诱抗活性 多年研究表明， 有广谱的诱抗活性，对茄科、葫芦科、菊科、豆科、十字花科、禾本科、锦葵科、蔷薇科等一年生或多年生、单子叶或双子叶植物均具有很强的诱抗作用，可诱导这些植物抵抗由卵菌、真菌、细菌、病毒和线虫引起的病害（表 1保护植物的叶部、根部和果实免受病害为害（ , et 2001, et 2002）。 温室 和田间的应用效果证明了 许多作物上的广谱诱导抗病作用。如以色列连续 3年对 间控制葡萄霜霉病 (效果进行了检测，结果表明用浓度为中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 2 制葡萄霜霉病的效果分别达到 60和 92%，与常用杀菌剂甲霜铜(防效相似，显著优于三乙膦酸铝 (灭菌丹 (苯并噻唑类制剂（ (, et , 2001)； 在比较 杨酸 ( 2,6 (室诱导花生抗叶斑病（ 试验中，发现 这几种诱抗剂中唯一一种有效控制叶斑病的化合物 (, et 2001)；另外在田间结合滴灌每隔 2 周用1mg/理植株 1 次，可有效控制西瓜枯萎病（ 的危害 (., 2002)；还有研究表明， 仅具有持久诱抗能力，而且还能促进植物的营养生长和生殖生长 (, et 2001)。这些结果都说明了 一种能够诱导多种植物产生广谱抗病反应的化合物。 植物线虫的诱抗活性 在一些常见的植物诱抗剂中， 氨基丁酸对线虫病害的诱抗效果突出。 研究发现，用氨基丁酸 、 、 三种异构体、水杨酸、茉莉酸和茉莉酸甲酯等诱导番茄对爪哇根结线虫（ 性，证明 氨基丁酸是唯一高生物活性物质， 氨基丁酸、茉莉酸甲酯仅具有较低的生物活性，植物抗病信号传导信号分子水杨酸和茉莉酸无诱导抗线虫活性（ Y,999）。随后， 又研究了 氨基丁酸对小麦线虫的诱导抗病性，结果证实 小麦根结线虫病和胞囊线虫病都有明显诱抗作用。（ 001）。 其他化合物的互作增效作用 多种杀菌剂、植物激活剂 ( , 2001)和促进植物生长的根瘤菌 (6混用具有互作增效的作用。据报道 氢氧化铜（ 霜脲氰 (三乙膦酸铝 (烯酰吗啉 (代森锰锌 (百菌清 ( 灭菌丹 (甲霜灵 ( 混用能明显提高番茄抗晚疫病，烟草、葡萄、黄瓜抗霜霉病的能力 (., 2002)；与三唑类杀菌剂混用抗白粉病的能力显著提高 (., 2002, ., 1998)。如在控制小麦白粉病的试验中，单独施用丙环唑 ( 250g/白粉病的侵染率仅分别降低 25%和 17%，若将两种 成份混合使用，则侵染率降低达 87%；同样将 不同比例同甲霜灵、 合后用于防治烟草霜霉病（ 在混剂施用浓度小于单剂单独施用浓度的情况下，防治效果远远超出了单剂的防效，高达 90%( ., 2002)。另外 脱乙酰几丁质（ 用对控制马铃薯块茎腐败病 (增效的作用 ( A, et 1998)；与亚磷酸钾 (作 则可有效控制番茄和黄瓜根结线虫 (为害 , ., 2001, , et 2001)；由此可见， 化合物的协同增效防病作用具有广阔的应用前景，但互作的机理尚未探明，有待进一步研究。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 3 表 1 导植物抗病性的抗菌谱 植物种类 原 铃薯 病疫霉 ; 链格孢 ; 骨木链孢菌 番茄 病疫霉 ; 葡萄孢 ; 病黄单胞杆菌 ; 茄尖镰孢菌番茄专化型 ; 执安棒杆菌 ; 辣椒 茄刺 盘孢 ; 椒疫霉 黄瓜 巴假霜霉菌 ; 丝壳白粉菌 ; 芦科刺盘孢 ; 香假单胞杆菌黄瓜角斑病致病变种 ; 哇根结线虫 ; 葡萄孢 花椰菜 生霜霉菌 ; 缘假单胞菌 ; 光假单胞菌 ; 莴苣 苣盘梗霉 椰菜 大头菜苔链格孢 ; 生霜霉菌 甜瓜 巴假霜霉菌 ; 镰孢菌甜瓜专化型 ; 诺单胞菌 西瓜 瓜尖链孢菌 拟兰芥 生霜霉菌 ; 葡萄孢 ; 茄假单胞菌 烟草 草霜霉 ; 生疫霉 ; 草华叶病毒 向日葵 日葵单轴霉 ; 日葵柄锈菌 康乃馨 镰刀菌 谷类 麦 麦 麦 囊线虫 ; 谷类胞囊线虫 玉米 珠镰孢菌 小米 生指梗霉 豌豆 腐丝囊霉 花生 座尾孢 葡萄 萄生单轴霉 苹果 交链孢 棉花 椒镰孢霉 ;丽花轮枝孢 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 4 使用方法及在植株体内的吸收、运转和代谢 理时间、方式及有效使用浓度 处理方式多种多样，常见的有喷雾、灌根和浸种，也可将 剂直接撒入土壤，或采用茎部注射，或将裸露的根、剪切的茎、叶直接浸于 液中。将叶片漂浮在液中也是一种有效便捷的方 法，可用于研究各种 生物的有效性和各种化合物对 导抗性的可逆程度。 同的处理方式对抗性的持续期有不同的影响，采用叶面喷雾法处理番茄， 1 次喷雾诱导番茄抗晚疫病的持效期达 12 天 (., 1994)；采用浸种法，诱导玉米抗霜霉病的有效期达 30 天 (, et 2001)。 导获得的保护效果与使用浓度相关，低浓度只诱导局部抗性，高浓度可诱导系统抗性。如用高于 1000g/ 导辣椒抗疫病、番茄抗晚疫病，其诱抗效果达 91%97%，处理植株的病斑小且发展缓慢； 度低于 500g/，番茄植株上下部叶片受到保护，但中部叶片发病严重，在辣椒上使用则诱抗效果更低。在可控的条件下，要获得高效的诱导抗性（ 90%），所需的 用浓度还取决于寄主、病原物及施用方式 29。通常喷叶处理的浓度（ 2501000g/灌根处理的浓度（ 20100g/高，这可能因为根部吸收能力大于叶部吸收的原因；而浸种处理需要的浓度要求最高，通常达到 1%( , et 2001, ., 1996)。 理时间与其他植物诱抗剂有所不同， 哚 只有在病原物入侵前处理才能使植物获得抗病能力 (, et 1994, , et 1997)，而接种前或接种后 1到 3天使用均表现出推迟发病的效果 (., 1994, , et 1999, ., 1994 , , et 2002 )。不过接种病菌后时间太长，使用 抗的效果亦不明显。如拟南芥在接种寄生霜霉菌 1 或 2 天后用 行处理，其孢子形成受到明显的抑制，孢子量分别减少了 但在接种后 5 天、 7 天再施用 效力丧失 (., 2002, , et 2000) 。大量研究表明， 导植物获得有效抗病性的使用时间为接种前或接种后 23 天以内。 物组织对 吸收 植株对 吸收取决于处理后间隔的时间、处理的部位、处理环境及植株成熟度等。 14C 标 记的 理番茄叶片，发现施用后 1 天仅有 9%的 植株吸收， 4 天后吸收率提高到 13%，但仅占全部用量中的很小一部分；若使喷在叶面上雾滴的挥发速度减慢，则植物体对 吸收率提高，如将经 理的叶盘密封在培养皿中， 723% (, .,1994)。处理部位对 吸收影响也很大，一般叶部吸收率大于根部，幼嫩部位较成熟部位易于吸收，如离体叶片通过叶柄末端吸收 2 个小时后，吸收率达 100%，而根部对 吸收在 2 天内仅达 36%( , .,1994)；用葡萄作为实验材料，观察到植株基部、中部、顶部叶片对 吸收率分别为 5%、 30%，再次证明了幼嫩部位为最易吸收部位。究其原因，也许与植株体表角质层厚薄有关。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 5 运转 不同的植物体内运转的方式不同，既可通过木质部输导，也可同其他氨基酸一样，借助于韧皮部从叶片转移到茎部，在那里完成更大范围的向上或向下的传送，根尖和茎尖是其集中聚集的地方 ( R., 1999)； 可借助于吸收作用从顶部向根部或块茎运转完 成向下传送， 14C 同位素示踪证明了 叶部向根部传导的结论，在一定程度上解释了喷叶和灌根处理均能诱导植株对线虫产生抗性的原因 (, .,1994)；向上运转则借助于蒸腾作用，当 用于根、叶柄末端或注射到茎部后，会随着蒸腾作用的液流向上移动(, et 1999)。 番茄和马铃薯吸收、系统运转方式不同，番茄用 14理叶片后，在 2 天内输送到植物生长最活跃的根尖和芽顶 (, .,1994)，马铃薯则可 能通过韧皮部传送到块茎中积累，相同的是两种作物内的 不会从嫩叶转移到老叶中 (., 2002)。 葡萄内的传送亦是如此，从中部叶片向上部嫩叶运转，而不是向下部老叶传递；但将 于葡萄基部叶片时，则发现 根部运转更明显 (, et 1999)。将 入烟草的茎基部，发现 基部、中部和顶部叶片中呈梯度分布，分别为 1%， 3%和 20%。所有研究都表明， 不同植株体内运转存在一定的差异，但对 收程度越高的组织 对病害的抗性越强 (, .,1994)，由此认为其运转与抗性呈正相关 (, et 2001, ., 1994 )。 新陈代谢 在植物体内， 乎不会被代谢掉。 研究证明了这点，他们发现被番茄、烟草和拟南芥吸收的绝大部分 可通过采用常用的氨基酸提取法，用 醇：氯仿：水）提取回收，只有一小部分（ 3%5%）留存于植物组织内不能被提取出来 (, et 2000, K, et 1997)。 导植物抗病的生理、生化作用机制 诱导抗病性，又称获得性抗病性，是植物在一定的生物或非生物因子的刺激或作用下，对后续侵染产生的抗性。 导植物抗病不是因为其本身对病原物具有毒性，而是诱导植物产生多种生理、生化防卫反应。 理屏障的产生 研究表明， 诱导植株细胞壁结构发生变化，产生胼胝质、形成乳突或导致细胞木质化等具有防止侵染和增强抗病性作用的结构。如 在 理的番茄叶片上观察到胼胝质 或木质素和胼胝质同时发生，接种晚疫病菌 72h 后，在被诱导的叶片上很难发现菌丝吸器形成，仅在外皮细胞间观察到被破坏的菌丝，而在对照叶片上则形成大量的吸器 (., 1994, ., 1994)； 用 导处理辣椒后接种辣椒疫霉病菌（ 在电子显微镜下观察发现，用 理过的植株，其细胞壁上有乳突的形成及胼胝质的沉积，病原菌的吸器被限制在这些又厚又密的乳突中难以扩展，从而导致病原菌入侵受阻 (, et 1994)；同样在 导拟南芥、花椰菜、葡萄抗霜霉病的研究中，也有类似结果报道 (国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 6 Y, et 1999)。但也有研究结果与此不一致，如用 理烟草后接种霜霉菌，虽能诱导对病原物的抗性，但并未发现胼胝质和木质素的形成 (., 1994)。可见 导产生的生理屏障在寄主 敏反应和活性氧物质的生成 过敏反应是一种快速防卫反应，其重要特征表现为小范围内细胞迅速坏死，从而对活体营养和死体营养的寄生物产生有效的抑 制作用。 研究 导番茄抗晚疫病的作用方式时，观察到用 理的叶片出现过敏反应现象，并且由于过敏反应的发生，抑制了晚疫病在植株内的扩展 (., 1994)，说明 导植物产生过敏反应后进入了一种对病原菌的防卫状态，使病原菌的侵入和扩展受到抑制，从而达到减轻病害的目的；但用 叶或灌根处理烟草 (., 1994 )、拟南芥 (., 2000)、番茄 (.,1994 )和花椰菜 (, et 2002)， 虽均可诱导产生系统获得抗病性（ 但发现只有喷叶处理在叶片上形成微小的过敏性坏死斑，说明过敏反应只是 导植物抗病的机制之一，其抗病反应是多种机理协同作用的。 对 导烟草抗 研究发现， 导细胞坏死现象的同时伴随着活性氧物质（ 如过氧化物、 迅速产生，并发