【毕业学位论文】（Word原稿）不同生境产甲烷古菌分离鉴定及初步应用研究微生物学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 不同生境 产甲烷古菌分离 鉴定及初步 应用研究 I 摘 要 产甲烷古菌属于古菌域的广古菌门，为严格的厌氧微生物。产甲烷古菌能够利用简单基质产甲烷。它们处 于厌氧发酵过程中最后一个环节，在自然界碳素循环中扮演重要角色。 研究 产甲烷古菌 ，对生物质能的利用有重要的应用价值。本研究选择从不同厌氧生境中分离、鉴定 产甲烷古菌 ，目的是丰富 产甲烷古菌 菌种资源，发现具有特殊性状的 产甲烷古菌 ，为沼气微生物菌剂的研制打下基础。 获得成果： 运用亨盖特厌氧技术从海底沉积物、厌氧消化器、酿酒窖池等生境中分离出 12株 产甲烷古菌 ， 分别属于 3 个属 6 个种 。 其中 氢营养型 产甲烷古菌 10 株（分别为 2522、3#、 4#、 ，甲基营养型和乙酸营养型 产甲烷古菌 2 株（ 分别为 1923）， 丰富了 产甲烷古菌 菌种 资源。 对胶州湾近海沉积物中分离的嗜热自养产甲烷杆菌 株 进 行 了 生 理 生 化 及 系 统 发 育 学 分 析 ， 初 步 鉴 定 为 新株。对 实验室 从油田采出水中分离的菌株 行生理生化及系统发育学分析，初步鉴定为 种。 分离出一株产胞外多糖的 923 菌株，并将其作为添加物用于沼气发酵实验，发现其在常温（ 2535）情况下，对沼气发酵的启动阶段有促进作用，缩短 31%的发酵启动时间，并在 3 在低温（ 1020）情况下，加大 1923 接种量（ ，发现其对总挥发酸尤其是丙酸的利用有一定刺激作用。这是国内首次以纯 产甲烷古菌 液作为沼气刺激因子进行实验，也为沼气复合菌剂的研制打下一定的基础。 关键词 产甲烷古菌 ， 沼气发酵 ， 刺激因子 of as of is an of is in of in of is of is to of to is a of as of 2522, 3#, 4#, f, 1923） , of of of 6S to On of a is 923 PS(in 5 5 of of 923 1% in in in 0 0 of in by of It of as in 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 2N，,2in 荧光原位杂交 h 时 -(2-( 乙烷磺酸 钟 三乙酸 氨基苯甲酸 合酶链式反应 哌嗪 - 1,4数每秒（转速单位） s 二 烷基磺酸钠 链构像多态性 度梯度凝胶电泳 段限制性片断长度多态性 俄勒冈产甲烷叶菌 里甲烷嗜盐 菌 合甲烷鬃毛菌 沃氏嗜热甲烷杆菌 热自养甲烷杆菌 德氏嗜热甲烷杆菌 氏甲烷八叠球菌 榈产甲烷袋状菌 氏甲烷球菌 海甲烷袋状菌 海底甲烷袋状菌 布尔日甲烷袋状菌 嗜热甲烷袋状菌 里亚萨 产甲烷菌 石油甲烷盘菌 氏叶 形甲烷菌 摩莎甲烷泡菌 游甲烷泡菌 氏甲烷螺菌 台湾甲烷卵圆菌 中兴甲烷卵圆菌 氏甲烷八叠球菌 西班牙产甲烷杆菌 录 第一章 引言 . 1 学依据 . 1 甲烷古菌 在碳素循环中的作用 . 1 甲烷古菌 作为古菌在系统进化中的地位和作用 . 2 甲烷古菌 在生物质厌氧消化中的作用 . 2 究的目的与意义 . 2 究目的 . 2 究意义 . 2 内外研究进展 . 3 内研究进展 . 3 外研究进展 . 4 究内容与主要技术路线 . 7 要技术路线 . 7 要技术方法 . 7 要研究内容 . 7 第二章 产甲烷古菌 的分离 及鉴定 . 9 验材料 . 9 验方法 . 9 集培养 . 9 离纯化 . 16 甲烷古菌 培养特征及生理生化特性鉴定 . 18 6S 列 扩增、测序及系统发育树构建 . 19 因组 G+量测定 . 21 果与讨论 . 22 集产物 . 22 离菌株概述 . 23 热自养甲烷杆菌菌株 分离 、 鉴定及系统发育学分析 . 27 烷袋状菌属新种菌株 列的分离 、 鉴定及系统发育学分析 . 34 章小结 . 41 第三章 菌株 1923 于沼气发酵实验的初步应用 .验材料 . 43 验方法 . 43 温发酵体系 . 43 低温发酵体系 . 44 据采集 . 44 V 果与讨论 . 44 株 1923 及其多糖的产生描述 . 44 温沼气发酵实验 . 45 低温沼气发酵实验 . 48 章小结与讨论 . 50 第四章 全文结论及 工作进一步展望 .论 . 52 同生境产甲烷古菌的分离、鉴定及系统发育学分析 . 52 株 1923 于 沼气发酵初步应用实验 . 52 在问题 . 52 作展望 . 53 参考文献 . 录 . 谢 .者简历 .国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引言 目前生物质能已成为仅次于煤、石 油和天然气的第四大能源，约占全球总能耗的 14。据预测，到 2050 年，生物质能用量将占全球燃料直接用量的 38，发电量占全球总电量的 17。在我国农村地区，生物质能的消 耗 量约占农村总能耗的 39，占全国能量消耗总量的 但是，目前我国生物质的利用存在着很大的弊端，一方面是在经济落后的边远地区，能源严重缺乏，农民为了获得生活能源，对森林进行掠夺性地采伐，森林资源遭到破坏，自然生态日趋恶化 ； 另一方面农民开始抛弃传统的秸秆燃烧，转向使用化石燃料，大部分农业废弃物就地焚烧，致使资源浪费和环境污染。 我国可以 开发利用的生物质能源有：各种农业废弃物（秸秆和谷壳等）、薪柴、林业废弃物（树叶和有机垃圾）和人畜粪便等。统计表明，我国秸秆、薪柴、粪便和垃圾四项资源分别相当于 吨 标准煤，总计约 吨 标准煤。生物质能源可再生而不会枯竭，同时起着保护和改善生态环境的重要作用，是理想的可再生能源之一。沼气的利用不但能解决农民的生活能源问题，缓解能源紧张的状况，还能够利用废弃物，减少环境污染。 然而沼气发酵技术还有不足 ， 如启动时间长 、 底物利用率不高 、 发酵异常波动等等。沼气发酵的本质是厌氧微 生物在特定条件下其生长代谢的生化反应过程的表现。沼气发酵技术的优劣，不仅与发酵工艺学有关，而且与人们对厌氧微生物的认识程度和驾驭能力有关。沼气发酵技术的进一步发展需要对不同底物条件下的沼气代谢过程及各功能菌群进行详细研究，形成有效可行的代谢调控技术；深入系统地研究沼气发酵的影响因素、刺激因子，通过有机组合配伍，形成高效沼气发酵促进剂 即 高效菌剂。 学依据 产甲烷古菌 是厌氧发酵过程中最后一个环节，在自然界碳素循环中扮演重要角色。由于 产甲烷古菌 在废弃物厌氧消化、高浓度有机废水处 理、沼气发酵及反刍动物瘤胃中 食物消化等过程中起关键性作用， 同时 产甲烷古菌 所释放出来的甲烷是导致温室效应的重要因素，因而， 产甲烷古菌 的研究成为厌氧环境微生物研究的热点之一。 产甲烷古菌 基因 组及甲烷生物合成研究有利于人们从基因组和分子水平 研究 古细菌进化 ， 阐明 产甲烷古菌 独特的代谢调控机制及其对环境的适应性 ， 进而为通过生物技术进行环境检测和环境治理奠定了基础。 甲烷古菌 在碳素循环中的作用 大气中的非生物来源的甲烷只占很小的比例，绝大部分是由生物生成， 据统计， 每年有 9 亿吨 的生物成因的甲烷产生。甲烷的形成是由各类微生物相互平衡协同作用的 结果，而 产甲烷古菌是厌氧生物链上的最后一环。 产甲烷古菌 与水解 菌 ，产氢产乙酸菌 相互依赖，相互制约。甲烷是相对稳定的气体，位于厌氧消化链末端的 产甲烷古菌 利用二氧化碳 /氢，乙酸及一些甲基化合物生中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 2 成甲烷，能够较快地从生存环境中逸出，使这些物质不产生积累，从而解除了生物链的 反馈抑制，使一系列的生化反应能持续不断的进行下去， 因此 产甲烷古菌 在维持生物链的碳循环上起着关键作用。 甲烷古菌 在系统进化中的地位和作用 1977 年，沃斯教授发现在温泉（高温 6575 ）无氧环境中生活着一种产甲烷古菌。根据 的鉴定，它是不同于地球上现有的细菌，判断它可在 34 亿年前生活，当时地球原始大气中只有二氧化碳和氢气而没有氧气，可以进行厌氧发酵的生活，把它认为是先于细菌和动植物的最早生命形态，属于第三类的古细菌界，是生命的第三种形态，这对生命起源的研究是一大贡献，也有助于了解太阳系其它星球发展的生命形态过程 (赵一章 1997)。 2006 年，新的 研究 表明，从西澳大利亚 拉通采集的距今 35 亿年的岩石样品中所发现的液体包容物是由微生物产生的。这是证明 产甲烷古菌 存在的最古老的证据，超过以前的地化证据约 7 亿年。该结果 代表着 产甲烷作用是 在地质记录中所发现的最早的微生物过程之一，它表明， 产甲烷古菌 在调控远古地球上的气候中可能曾扮演过一个角色 (006)。 甲烷古菌 在生物质厌氧消化中的作用 产甲烷古菌与水解菌群、产氢产乙酸菌群一起构成厌氧消化中的三大菌群。乙酸 营养型 产甲烷古菌 具有质子调节作用，即能够利用产氢产乙酸菌代谢产生的乙酸，维持 稳定。而氢营养型 产甲烷古菌 代谢氢，从热力学上为产氢产乙酸菌代谢多碳化合物提供了最适条件。所以，从某种意义上说， 产甲烷古菌 的数量和活性可作为整个厌氧消化系统是否稳定运 行的重要检验指标之一。 究的目的与意义 究目的 应用经典亨盖特厌氧分离方法从各种生境中富集分离 产甲烷古菌 ，并进行生理生化鉴定，以获得具有优良性状的 产甲烷古菌 而用于厌氧消化器和传统的沼气池中，与其他菌群配伍形成微生物菌剂，从而提高产沼气的效率和稳定性。 究意义 通过 产甲烷古菌 的筛选，鉴定获得具优良性状的 产甲烷古菌 株，既能 丰富产甲烷古菌菌种资源， 为微生物菌剂的研制提供基础，还可为 产甲烷古菌分子生物学和代谢机理的研究提供基本材料 。 为厌氧消化的调控技术的研究打下基础。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 3 内外研 究进展 内研究进展 在 产甲烷古菌 新菌的分离鉴定方面，近五年主要是中科院微生物所菌种资源中心的细菌分类研究组在进行这方面的研究， 2001 年从啤酒厂的厌氧消化器中分离出弯曲甲烷杆菌新种，经 16S 列 分析，归为甲烷杆菌属 (孙征 2001)。 2005 年从厌氧消化器中分离 为甲烷杆菌属 (005)。 在产甲烷作用方面研究较多，国内基本可以分为三个部分，水稻田，厌氧消化器，油田。关于水稻田中产甲烷作用。中国农大的 陆雅海教授 等 ，用稳定同位素示踪技术深入研究了水稻光合碳在地上地下部的分配规律，发现水稻光合同化碳通过根系分泌作用快速向土壤微生物转移的现象。并用现代分子生态技术和稳定同位素示踪技术相结合的手段研究了水稻根际碳循环的关键微生物种群和功能，用 产甲烷 古菌 (005)。关于农药和除草剂及转基因作物对水稻田里的 产甲烷古菌 的影响也有部分报道，除草剂二氯喹啉酸对水稻田中的产甲烷有强烈的抑制作用，但低浓度的二氯喹啉酸毒性效果经过一段滞留期会消除 (吕镇梅 2004)。低 浓度的呋喃丹和丁草胺可增加黄松稻田土壤 产甲烷古菌 种群数量和甲烷排放通量 ， 但加入呋喃丹，丁草胺和多菌灵超过一定浓度会抑制产甲烷作用，且加入量和抑制时间成正相关 (陈中云 2003)。农药甲胺磷，乙草胺也有相似的情况 (邓晓 2004)。转 甲烷古菌 的数量有抑制作用，但对其活性和多样性的影响可在一定时间内消除 (徐晓宇 2004年 5月 )。 厌氧消化器中，涉及各种工艺对 产甲烷古菌 的影响较多，在两段式 粒污泥的性能与其结构、细菌种类和颗粒体内细菌分布情况有很大 关系，颗粒污泥结构对巴氏甲烷八叠球菌的保护作用使其能在 周雪飞 2004)。以乙醇和乙酸为主要末端产物的产酸相乙醇型发酵有利于产甲烷相功能的发挥，乙醇型发酵是充分发挥两相厌氧系统功能的最佳发酵类型 (任南琪 2003)。中山大学环境科学与工程学院的贾晓珊，李顺义为我们提供一个明确的实际厌氧废水处理过程中 产甲烷古菌 (硫酸盐还原菌（ 争机理的动力学研究方法 (贾晓珊 2003)。 产甲烷古菌 还可用于对一些有毒物质的厌氧消化，原因是产甲烷古菌 对这些毒物不敏感，如硝基和偶氮基芳香 化合物在 产甲烷古菌 群作用下较易还原脱毒，转化为相应的芳香胺类，其毒性要小几个数量级，因而有些毒性很高的芳香化合物废水可利用厌氧反应器处理，而且反应过程中发现一些芳香胺类化合物可被完全矿化，表明一些含氮芳香化合物可作为厌氧菌的碳源和能源，在厌氧条件下被完全生物降解 (于建伟 2004)。除传统的单纯 子生态的分析技术也被用于厌氧消化中的 产甲烷古菌 群的分析，中科院通过构建 16S 豆腐废水 和传统的解了反应器中 的主要功能菌群，其中 33%的 16S 甲烷古菌 。而且为分离特异种群提供了指导 (张春杨 2004)。 除了稻田和厌氧消化器中 产甲烷古菌 的研究外，还有油田中的 产甲烷古菌 的研究这几年也常被涉及。 总体来说，目前国内关于 产甲烷古菌 的研究偏重对整体 产甲烷古菌 群影响方面的较多，而关于具体的机理及 产甲烷古菌 与其它菌相配伍形成菌剂的研究较少见。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 4 外研究进展 1、 产甲烷古菌 的系统分类学及系统发育多样性 产甲烷古菌 目前分为 5个目， 10个科， 30个属， 140多种（包括 从 2000年 到 2006年共有 22个新种发现，分属于甲烷杆菌属（ 3种） (005, 004)，甲烷短杆菌属（ 4种）(003)，嗜热甲烷杆菌属（ 1种） (000)，甲烷袋 状 菌属（ 2种） (003)，甲烷球菌属（ 1种） (006)，甲烷暖球菌属（ 3种） (004)，甲烷八叠球菌属（ 2种） (000)，拟甲烷球菌属（ 1种） (005)，甲烷泡菌属（ 1种） (005)，甲烷食甲基菌属（ 2种） (005, 002)，甲烷微球菌（ 1种） (000)，甲烷鬃毛菌属（ 1种） (006)。样品来源地主要有：海洋（浅海，深海）沉积 物 (最多 )，厌氧消化器，水稻田，蟑螂后肠，动物粪便，湖泊。来 自美国 、 德国 、 日本 、 中国 、 法国 、 丹麦 、 俄罗斯（耐寒）等国家和地区。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 5 图 1 产甲烷古菌 分类图 of 、 产甲烷古菌 生态学研究 自 然界有三类产甲烷生态系统： 1、在 湖泊和海底的沉积物，湿地，沼泽，水稻田，污泥 等环境中 ， 整个 代谢 途径较为完整 。 2、反刍动物，一些生物的肠道内， 有机物的代谢因动物肠胃的吸收而被阻断 ， 因而 有很多中间代谢物产生。 3、有机物匮乏的环境，如地热温泉中， 产甲烷古菌 利用地质过程中产生的氢来生产甲烷(000)。 产甲烷古菌 能适应多种温度，存在的范围很广，从 5 到 110 都有存在。嗜热的 产甲烷古菌中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 6 占已知的 产甲烷古菌 的 23%。尽管在酸环境下产甲烷作用也能发生，但大多数 产甲烷古菌 只能在很窄的 种适酸菌 ， 能够在 若低于 06年发表的一株分离自泥炭沼泽的嗜酸的 产甲烷古菌 能够在 目前为止最耐酸的 产甲烷古菌 (006)。产甲烷杆菌属的两种嗜碱 产甲烷古菌 能够在 的生境中生长，另有两种氢营养型的嗜盐 产甲烷古菌 烷叶菌属） 和 烷咸菌属）能在 产甲烷古菌 对盐的适应性随着种的不同有很大的不同，海洋 产甲烷古菌大多是嗜盐的，尤其是 甲烷球菌属 ， 产甲烷古菌 属 ， 甲烷暖球菌属 和大多数甲基营养型 产甲烷古菌 如：甲烷嗜盐菌属，甲烷盐菌属 ， 甲烷咸菌属 等， 它们存在于 盐湖，含盐的油层水。甜菜碱（ 作为一种相容性物质，其 浓度 与菌体对 盐的耐受能力 有关 。 产甲烷古菌 在复杂的厌氧消化体系中处于十分重要的地位， 产甲烷古菌 能够使中间产物转化成最终产物甲烷，从系统中释放，从而解除整条厌氧消化链的产物 抑制。 对不同生境中产甲烷作用的研究也由于新技术的应用而更加的深入。 近十年来厌氧消化被广泛用于处理各种高浓度的废水，如畜禽粪便和城市废水。随后，也被用于在不同温度下处理较低浓度或复杂的废水，而产甲烷作用为厌氧消化作用中两个主要限速过程之一，因而迅速检测 产甲烷古菌 种群结构和活性，成为监控厌氧消化器的正常运行的手段之一。而基于 析 出一个生态系统的群落结构，因此也常被用于 产甲烷古菌 菌群的检测。在多数厌氧消化中，从乙酸转化来的甲烷占 总含量的 70%多，因此，乙酸型 产甲烷古菌 在稳定的厌氧消化过程中扮演重要的角色，它们的稳定在某种意义上也可以代表整个厌氧系统的稳定。 甲烷古菌 的系统发育多样性，设计了不同类型的杂交探针并用于厌氧生物反应器中 产甲烷古菌 群的定量分析(