【毕业学位论文】（Word原稿）小尾寒羊TGF-β1和GDF9基因多态性及其与繁殖力关系的研究动物遗传育种与繁殖硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 小尾寒羊 因多态性 及 其 与 繁殖力关系 的研究 I 摘 要 家畜的繁殖性状是重要的经济性状之一 。 由于绵羊产羔数性状遗传力低（仅为 通过常规选择方法难以提高，因此寻找控制排卵 数乃至产羔数的主效基因研究，已成为各国绵羊育种学家关注的焦点。不同绵羊品种排卵率的遗传变异为探讨卵泡发育调节机理，研究基因控制排卵数提供了一个理想的模型，使得排卵数主效基因的鉴别成为可能。 本研究以转化生长因子 1（ 生长分化因子 9（ 为小尾寒羊高繁殖力性状的候选基因，对其进行多态性分析，以探讨这两种细胞因子与绵羊繁殖性能的关系。试验选用小尾寒羊、滩羊、同羊、欧拉羊共计 196 头为研究材料 ,采用 术分析不同绵羊品种 两个基因的遗传 变异 ,结果如下： 1、对绵羊 因 2 5、 6 7 外显子间扩增片段进行分析，在 6 7 外显子区的 805 对 6 7 外显子区进行克隆测序，测序结果表明第 7 外显子上游的第 294 位碱基处缺失了列 :的 14 201 位）。不同绵羊群体的基因型和基因频率统计显示 ,多胎品种小尾寒羊以 因型为主 ,单胎品种滩羊、同羊、欧拉羊以 因型为主， 属于中度多态 。对突变位点进行调控元件及蛋白结合位点的预测，结果显示 相比 B 型产生了三个转录因子活化蛋白 )。小尾寒羊产羔数的最小二乘均值关系为 3种基因型间差异不显著（ P 2、对绵羊 因在其第 2 外显子上设计 4 对引物分别扩增进行 析 ， 仅在引物 发现有多态位点 。 引物 小尾寒羊、滩羊、同羊、欧拉羊 4 个绵羊品种中都检测到2 处碱基突变 (558 位 TC 和 692 位 TC)，表明在 4 个绵羊品种中均发生了新的 558 位 TC 和692 位 TC 位突变，该突变导致 231 位氨基酸异亮氨酸变为苏氨酸。该突变在 4 个绵羊品种中均为低度 多态。 因型小尾寒羊平均产羔数比 因型多 ，差异显著（ AA an t P 4 to in in 2 TC 58 C 92) 2 a C 58 C 92 in 31 in an C 提前在 65水浴中预热）到 中，室温或 37 放置 2 分钟， 第二章 材料与方法 21 12000心 1 分钟，离心管中液体即为回收的 断，可立即使用或保存于 备用 纯化后的 别用 2%和 琼脂糖凝胶检测：取 2 3l 纯化的 液与 1l 加样缓冲液混匀，点样（含 B） ,同时上样一个相应的 记。 化的 增 产物的克隆 隆用载体 由于在 增中， 大多在扩增产物的 3。根据这一特性，本实验采用 司的 体以快速克隆 物。这种载体两端特定地加上了一个 T，这样既可以防止载体地自身环化又为 物提供了配对碱基，从而有效地提高了克隆效率。 化的 物与载体的连接 计算插入片段与载体的量，即插入 载体的摩尔比。一般插入片段的分子摩尔数：载体分子摩尔数 3 8： 1，对大多数待克隆片段的连接均能得到较好 的实验效果。 纯化的 段与 体在 （ 司 ，已包含有 接酶， 作用下 4 连接过夜。 连接反应体系（ 10l） 体 1l 纯化 物 4l 5l 4 连接 24h,取 10l 混合的连接液进行转化， 粒 小规模制备（碱裂解法） 挑取 板上得到的数个白色单菌落，分别接种于 5 100g/ 体培养 基中， 37 振荡培养 8 12h,同时挑取一个蓝色菌落作为阴性对照 吸取 1 菌培养液于 心管中， 120004 离心 5 弃上清，用灭菌的生理盐水洗涤细菌沉淀两次，每次尽量吸尽上清 加 100l 预冷的质粒提取液 I 重悬菌体（充分混匀），冰浴 3 加 200 ，立即颠倒混匀至液体变得清亮，冰浴 5 再加入 150 ，冰浴 5 第二章 材料与方法 22 4 , 12000g 离心 5取上清 2 倍体积的 冰 乙醇沉淀质粒 , 12000心 5上清 质粒用 70%的乙醇洗涤两次 ,除净乙醇 37 烘干 ,加 50l 解 ,加 1l(终浓度为 20g/ 4 贮存 质粒 酶切鉴定 酶切反应体系 10l: 质粒 3l 限制性内切酶 5U 10限制性内切酶用 1l 用高压灭菌双蒸水将体系补足为 10l 37 水浴消化 2h。 质粒 序列测定 取经鉴定，重组成功的阳性克隆 的菌液 1交上海生物 工程 有限公司进行测序。 统计分析方法 因频率和基因型频率的计算 基因频率 是指一个群体中某一基因对其等位基因的相对比率 2(+(,与 i 共显的第 1 到 n 个等位基因 基因型频率 是指一个群体中某一性状的各种基因型之间的比率 基因型频率 =基因型个体数 /测定群体总数 因和基因型频率的差异显著性检 验 ( 首先根据基因频率计算各种基因型频率的理论值，然后计算 2 值。由于本研究资料的自由度，某些基因型的理论次数小于 5，因此采用矫正公式： 第二章 材料与方法 23 i 论值 际观察值 n:等位基因数 矫正后的公式为： 论值 际观察值 n:等位基因数 羊 因的遗传多态性分析 4 个 品种 绵羊 群体 衡状态的检测 衡是指在一个无穷大或足够大规模的，封闭的，随机交配的孟德尔群体中，基因频率和基因型频率在世代交替过程中保持稳定不变。而且，基因频率和基因型频率间存在简单关系。 绵羊 因的杂合度，有效等位基因数以及多态信息含量的计算 1、 遗传纯合度（ :某一群体中一个特定的基因位点上等位基因纯合的纯度。 2、 遗传杂合度（ :与纯合度相对 3、 有效等位基因数（ of :纯合度的倒数，反应 等位基因间的相互影响，是衡量基因纯合度的又一指标。 4、 多态信息含量（ 用于对标记基因多态性的 估计。 高度多态， 中度多态， 低度多态。 mi mi C 1 11 1 222 21 别为第 i 和第 j 个等位基因在群体中的频率， m 为等位基因数。 最小二乘方差分析 配合下列模型进行最小二乘方差分析，比较小尾寒羊产羔数在基因型之间的差异： y=+ Gi+e 其中： y 为产羔数的记录值； 为群体均值； 第 i 种基因型的固定效应； e 为随机残差效应。用 学习版 ）的 程完成。 2 （ E i 1/2） 2 Ei 第三章 结果与分析 24 第三章 结果与分析 因组提取结果 图 3从血液中提取的基因组 脂糖凝胶电泳检测。 图 3羊血液提取的基因组 电泳结果 NA 3从耳组织中提取的基因组 在 脂糖凝胶电泳检测。 M 图 3羊耳组织提取的基因组 电泳结果 NA 以上的电泳检测图谱可以看出，基因组的大小大约在 50上 ,且提取的基因组 乎没有托尾现象。经检测所提取的 度大约为 500l，结果表明提取的基因组 降解，可直接用于 增反应。 因 增及多态检测的结果与分析 3 外显子 增及 态检测结果 本实验中，根据 表的牛 因（登录号： 列与绵羊该基因的 列 （登录号： 7164398） 比对后 共设计 8 对引物，由上海 生工 生物有限公司合成。 之 后以所提取的绵羊基因组 模板进行 异性扩增，扩增结果见图 3 图 3 3 外显子扩增 (1088CR 3 088 第三章 结果与分析 25 对 3 外显子序列进行酶切位点分析，分别用 三种内切酶对该片段进行限制性酶切分析，酶切产物用琼脂糖凝胶进行电泳检测，没有发现酶切多态位点。 4 外显子 增及 态检测结果 4 外显子扩增产物为 2287增结果见图 3在已扩增 产物中间设计引物 ,将该片段分为 1100 1200个片段去扩增 ,在这两个扩增片段中分别用内切酶消化 ,上半部分用切，无多态产生，下半部分用 切， 有切开， 图 34 外显子扩增 (2287 CR 4 287 5 外显子 增及 态检测结果 4 5 外显子扩增产物为 233扩增产物进行不同绵羊品种的 析，没有发现多态位点。 图 3 5 外显子扩增 (233CR 5 33 第三章 结果与分析 26 图 3因 4 5 外显子的 析（ 12%聚丙烯酰胺凝胶） 2 % p e 5 an 7 外显子 增及 态检测结果 7 外显子扩增产物为 805该扩增产物上设计了 4 对引物，将其分别扩增，产物长度分别为 265236222193扩增产物分别进行 析，结果显示在第2 对，第 3 对引物上出现多态位点，其余 2 对引物无多态位点。不同引物 增结果见图 3同对引物 果见图 3 A： 7 外显子扩增产物（ 805 A： fo r 6 7 e (805 B： 7显子扩增产物（ 265 B： 7 -1 o f 265 第三章 结果与分析 27 C： 7显子扩增产物（ 236 C： 7 -2 e (2 36D： 7显子扩增产物（ 222 D： fo r 6 7 -3 o f 222E： 7显子扩增产物（ 193 E： 7 -4 e (1 93图 3 7引物 增产物 fo r 4 7 第三章 结果与分析 28 A： 7段 果（ 265 A:an o f 7-1 265 B： 7段 果（ 236 B: an o f 7-2 t（ 236b p） C： 7段 果 (222C: an o f 7-3 t（ 222b p） 第三章 结果与分析 29 D： 7段 果 (193D: an o f 193 图 3 7 4 对引物 果 fo r 4 -7 o f e 不同片段 态检测结果分析 对 因 不同片段扩增产物进行多态分析，在 7 外显子中设计的 4 对引物中有 2 对引物有多态位点的出现，对不同绵羊群进行凝胶电泳分析，表明第 3 对引物不具有群体普遍性，只有第 2 对引物所扩增的产物在各个群体中均有不同基因型的存在。对 7 个个体进行克隆测序， 用 析软件对所测结果进行分析，并上传到 。 结果见图 3示 。 因型的碱基序列与 序列一致，纯合性 比杂合性 294 位（序列 6871756 中的 14 201 位）缺失了 个碱基，而纯合性 相比 在 180（序列 6871756 中的 14 315 位） T 替换为 C。 ge n ot yp e AA ge n ot yp e C d e le t i T C） AA ge n ot yp e B B ge n ot yp e 图 3同基因型测序结果 o f e 不同绵羊品种 基因外显子 6 7 的基因频率和基因型频率的分析 对小尾寒羊、同羊、滩羊、欧拉羊进行了 因外显子 6 7 的基因型检测， 第三章 结果与分析 30 同绵羊品种的基因型频率和基因频率。统计结果见表 3表 1 可见，在 4 个绵羊品种中，均检测到 3 种基因型，且等位基因 B 略占优势，其频率在 合性 2检验结果表明 ， 4 个群体在该位点的基因频率均处于 衡状态。 表 34 个绵羊品种 位基因频率 e an d o f o e 品种 数量基 因 频 率 e 基 因 型 频 率 2 c A B B 尾 寒 羊 93 2/93) 7/93) 4/93) 0 760 同羊 43 14/43) 14/43) 15/43) 0 953 滩羊 32 ) 1/32) 8/32) 0 283 欧 拉 羊 28 ) ) 5/28) 0 618 d f= 1， 2 0 。 05=2 0 。 01=2 c ( 0 . 0 5 ) 0 . 0 5 ,差异不显著 . d i ff e r n o s i gn i fi c a n t l y 同绵羊品种 基因外显子 67 基因型分布差异性检验 不同绵羊品种 因外显子 67 基因型分布差异检验的结果得出 2=2 P 异显著，对其进行分割检验，由表 3知，小尾寒羊和滩羊、欧拉羊 因型分布差异显著 (P 0 . 5 为高度多态， 0 . 5 P 0 . 2 5 为中度多态， P 3 种基因型间差异不显著（ P 在的调控元件及蛋白结合位点的预测 通过网站： (算机软件分析预测转化生长因子 1第 6 内含子内由于点突变造成的调控位点的改变 预测分值大于85 有效）显示 ,由于多了 碱基 ,相比 B 型产生了 3 个转录因子活化蛋白)。 201 （ 录号： 分别对其进 行增及 析。 泳结果见图 3果见图 3 A： 171 A： fo r 171 B： 283 B： 283 C： 289 C： 289 D： 306 D： fo r 306图： 3 对引物扩增产物 p o f 第三章 结果与分析 33 A： 结果 (171 A: an o f 171 B： 结果 (283 B: an o f 283 C： 结果 (289 C: an o f 289 第三章 结果与分析 34 D： 结果 (306 D: an o f 306 图 3因 4 对引物 果 fo r 4 o f 2 外显子 4 对引物 果分析 对 2 外显子上 4 对引物进行 析后，仅在第 2 对引物上发现有多态位点，其余 3 对引物均无多态位点出现。将第 2 对引物扩增片段 种基因型各取 2 个个体的物进行克隆测序。用 析软件对所测结果进行分析，并上传到 。结果见图 3示。 因型个体在箭头所指处碱基为 C，而 因型个体在箭头所指处为 T，可见 处 C应于绵羊 第 558 位和 692 位。 绵羊 因 列的第 558 位和692 位碱基均为 T，因此将 定为野生型， 定为突变型， 该突变引起了氨基酸的改变，导致 231 位氨基酸异亮氨酸变为苏氨酸。 T C） T C） 图 3同基因型测序结果 o f 第三章 结果与分析 35 不同绵羊品种 因 物的基因频率和基因型频率的分析 对小尾寒羊、同羊、滩羊、欧拉羊进行了 因 物的基因型检测，计算了不同绵羊品种的基因型频率和基因频率。统计结果见表 3由表中可见，在 4 个绵羊品种中，均检测到 种基因型， 合型没有出现，适合性 2 检验结果表明 ， 4 个群体在该位点的基因频率均处于 衡状态。 表 34 个绵羊品种 因的基因型、等位基因频率 e o f o e 品种 数量基 因 频 率 e 因 型 频 率 2c C D D 小 尾 寒 羊 3 0 903 2 0 096 8 0 806 5（ 75/93） 0 193 5（ 18/93） 0 037 5 同羊 43 0 872 0 0 128 0 744 2 （ 32/43） 0 255 8 （ 11/43） 0 065 6 滩羊 32 0 875 0 125 0 75 （ 24/32） 0 25 （ 8/32） 0 062 5 欧 拉 羊 28 0 928 6 0 071 4 0 857 1 （ 24/28） 0 142 9 （ 4/28） 0 020 4 d f= 1， 2 0 。 05= 3 . 8 4， 2 0 。 01= 6 . 6 3 , 2 c ( 0 . 0 5 ) 0 . 0 5 ,差异不显著 . d i ff e r n os i gn i fi c a n t l y 同绵羊品种 因 物基因型分布差异性检验 不同绵羊品种 因 物基因型分布差异检验的结果得出 2=2 P异不显著（ 因的杂合度、有效等位基因数合多态信息含量 表 34 个绵羊品种 纯合度、杂合度、有效等位基因数和多态信息含量 h e o f in fo ur 遗 传 参 数 小 尾 寒 羊 sh 同羊 滩羊 欧 拉 羊 ： P 0 . 5 为高度多态， 0 . 5 P 0 . 2 5 为中度多态， P B 3种基因型间差异不显著。 对引物在 4个绵羊品种中均出现 多态位点在不同品种间基因型表现差异不显著，属于低度多态。克隆测序发现 4个绵羊品种中发生了新的 558位 T 92位 T 突变导 致 231位氨基酸异亮氨酸变为苏氨酸。 异显著。 在 数进行 关联 分析 , R= R=R= 参考文献 41 参考文献 1. 杜立新等 记的研究，动物遗传育种研究进展 (陈宏权主编 )，中国农业科技出版社， 2001， 96 99 2. 范青松 ,等 中国养羊 ,1992,(1):7 9. 3. 高惠娟综述，周馥贞审校 卵巢功能调节 1996 15 (2) 94 97. 4. 贾志海 ,等 . 关于小尾寒羊生产性能的有关问题答读者问 1997, (2):55. 5. 李碧侠，储明星，王金玉 . 绵羊 因 析 . J2003, 30(4):307 310. 6. 柳淑芳 , 杜立新 ,闫艳春 研究进展 J2003,35,2 7. 刘振兴山东省济宁地区的小尾寒羊中国半细毛羊， 1983， 2： 17 22 8. 吕时铭，吕红等 转化生长因子参与调节颗粒细胞雌孕激素的分泌中华检验医学杂志 2001，24， 5： 278 281 9. 施启顺畜禽主基因研究进展湖南农业大学学报， 1999， 25（ 1） 1 3 10. 田振成小尾寒羊在辽宁东部山区饲养效果观察辽宁畜牧兽医， 1995， 6： 15 17 11. 王建民 ,秦孜娟 ,曲绪仙 ,王中华 ,李福昌 进展 (上 )1997,(3):6 10. 12. 王景元荷泽地区绵羊杂交改良现状的分析中国养羊， 1985， 2： 1 3 13. 王树山 ,等 . 小尾寒羊在洮南市农区适应性观察 . 中国养羊 ,1997,(1):16 17. 14. 武艳萍猪转化生长因子 基因多态性与猪产仔数关系的研究中国农业大学博士论文北京， 2005 15. 吴泽辉，储明星，李学伟 . 生长分化因子 9 基因及其在生殖中的作用 . J 2005，27(3):481 486. 16. 姚树清，阎奋民，游稚芳，李梦考 ，王振成，孔凡礼，窦勤伟，李好岱 . 小尾寒羊优异特性及利用途径探讨 . 中国养羊 ,1994,(3):1 5. 17. 阎运清 ,等 . 小尾寒羊繁殖性能研究初报 . 中国养羊 , 1986,(3):1 3. 18. 周长春 ,刘芝华 ,齐 军 肿瘤的关系研究进展 J2006,14(1): 1 5. 19. 章亨璆 . 谈小尾寒羊繁殖性能的开发利用 . 中国养羊 , 1995,(2):27 29. 20. 朱 瑾 ,周剑萍 ,张 炜 . 白在胚胎着床前后小鼠子宫内膜的表达