第十三章 可见分光光度法和紫外分光光度法

第十三章可见分光光度法和紫外分光光度法 VisibleSpectrophotometryandUltravioletSpectrophotometry 内容提要 一 物质的吸收光谱二 分光光度法基本原理1 透光率和吸光度2 Lambert Beer定律三 可见分光光度法1 分光光度计2 测定方法四 提高测量灵敏度和准确度的方法五 紫外分光光度法简介 教学基本要求 掌握分光光度法的基本原理 Lambert Beer定律以及透光率 吸光度 摩尔吸光系数等基本概念及相互关系 熟悉物质对光的选择性吸收 吸收光谱的意义 可见分光光度法的测定方法 标准曲线法和标准对照法 了解光的基本性质 光的加和性 分光光度计的基本构造 比吸光系数比较法 差示分光光度法和双波长法的测定方法 提高测量灵敏度和准确度的方法 紫外分光光度法的一般概念 第一节物质的吸收光谱 一 物质对光的选择性吸收光照射某物质 物质能够吸收光 使原有的基态转为激发态 只有当分子的能量 h 与被照射物质粒子的基态和激发态能量之差 E 相等时才能被吸收 M 基态 h M 激发态 物质对光的吸收具有选择性 若溶液选择性地吸收了某种颜色的光 则溶液呈吸收光的互补光 第一节物质的吸收光谱 互补色光示意图 第一节物质的吸收光谱 二 物质的吸收光谱将不同波长的单色光依次通过有色溶液 测量溶液的吸光度A absorbance 以波长 为横坐标 吸光度A为纵坐标作图 得吸收曲线 或称吸收光谱 吸收光谱中 吸光度最大处的波长为最大吸收波长 用 max表示 一般 max是定性鉴别物质的基础 不同浓度的溶液 max不变 浓度与峰值成正比 这是进行定量分析的依据 第一节物质的吸收光谱 三 邻二氮菲 合铁 II 离子的吸收光谱图 absorptionspectrum max 510nm不同浓度的溶液 max不变 浓度与峰值成正比 第二节分光光度法基本原理 一 透光率 transmittance 和吸光度 absorbance 入射光强度I0 吸收光强度Ia 透过光强度It 反射光强度为IrI0 Ia It Ir被测溶液和参比溶液的吸收池同样材料和厚度 反射光强度影响相互抵消 上式简化为I0 Ia It 第二节分光光度法基本原理 一 透光率和吸光度透射光的强度It与入射光强度I0之比称为透光率 transmittance 用T表示透光率的负对数称为吸光度 用符号A表示 A愈大 溶液对光的吸收愈多 第二节分光光度法基本原理 二 Lambert Beer定律Lambert Beer定律 A bc溶液厚度b 单位cm 浓度c 单位mol L 1 摩尔吸光系数 molarabsorptivity 单位 L mol 1 cm 1若用质量浓度 代替cA ab 质量吸光系数 apercentangeabsorptivity 单位 L g 1 cm 1a和 可通过下式相互换算 aM 当溶液组成表度为10g L 1时 吸光系数可用比吸光系数表示 与 和a的关系分别为 第二节分光光度法基本原理 第二节分光光度法基本原理 透光率T与溶液浓度c 或液层厚度b 之间的关系也可以以指数函数关系来表示 lgT bcT 10 bc 第二节分光光度法基本原理 应用Lambert Beer定律时 需注意以下几点 Lambert Beer定律仅适用于单一波长的单色光 入射光的波长范围越宽 则测定结果越容易偏离Lambert Beer定律 吸收过程中各物质间无相互作用 但各物质的吸光度具有加和性 即A Aa Ab Ac 入射光波长不同时 摩尔吸光系数也不同 摩尔吸光系数越大 溶液对入射光的吸收就越强 测定的灵敏度就越高 分光光度法仅适用于微量组分的测定 或a 确定是在低浓度下测定吸光度A 通过计算求出 第二节分光光度法基本原理 例13 1已知某化合物的相对分子质量为251 将此化合物用乙醇作溶剂配成浓度为0 150mmol L 1的溶液 在480nm波长处用2 00cm吸收池测得透光率为39 8 求该化合物在上述条件下的摩尔吸光系数 及质量吸光系数a 第二节分光光度法基本原理 解由Lambert Beer定律可得已知c 0 150 10 3mol L 1 b 2 00cm T 0 398代入 第二节分光光度法基本原理 例测试酶与腺苷酸 AMP 体系的吸光度如下 A 280nm 0 46 A 260nm 0 58试计算每一组分的浓度 已知 酶的 280nm 2 96 104L mol 1 cm 1 260nm 1 52 104L mol 1 cm 1AMP的 280nm 2 4 103L mol 1 cm 1 260nm 1 5 104L mol 1 cm 1吸收池厚度为1 00cm 第二节分光光度法基本原理 解设酶和AMP的浓度分别为y和z因吸收光的加和性 为260nm0 58 1 52 104 1 00 y 1 5 104 1 00 z 为280nm0 46 2 96 104 1 00 y 2 4 103 1 00 z解方程得 y 1 4 10 5 mol L 1 z 2 5 10 5 mol L 1 即酶的浓度为1 4 10 5mol L 1 AMP的浓度为2 5 10 5mol L 1 第三节可见分光光度法 一 分光光度计 spectrophotomete 主要部件光源 单色器 检测器 吸收池 指示器光源 钨灯 发出320 3200nm的连续光谱 单色器 以棱镜或光栅分光 提供单色光 吸收池 分光光度计中用来盛放溶液的容器 检测器 通过吸收池的光转换为光电流 再经放大输入指示器 然后显示 指示器 显示A或T 第三节可见分光光度法 a 自准式单色光器示意图 b 棱镜对光的色散作用 第三节可见分光光度法 二 测定方法标准曲线法取系列浓度标准溶液 测定吸光度A 作吸光度A对溶液浓度c的图 得过坐标原点的直线 在相同条件下 测量被测溶液的吸光度 在标准曲线上查得溶液度 维生素B12的标准曲线 第三节可见分光光度法 标准对照法预先配制一个与待测液浓度相接近的标准溶液 其浓度用cs表示 测得其吸光度为As 再测定待测液的吸光度Ax 则待测液浓度cs可从下式求得 第四节提高测量灵敏度和准确度的方法 一 分光光度法的误差仪器测定误差光电管灵敏性差 光源不稳定及读数不准 透光率误差 T引起浓度误差 c 透光率20 65 A为0 2 0 7时 浓度相对误差较小 测量误差和透光率的关系 第四节提高测量灵敏度和准确度的方法 溶液偏离Beer定律偏离Beer定律 A c曲线弯曲 主要原因 化学因素吸光物质发生解离 缔合 溶剂化等现象 光学因素复色光引起对Beer定律的偏离 主观误差 两种不同吸光系数的混合光对Beer定律的偏离 第四节提高测量灵敏度和准确度的方法 二 提高测量灵敏度和准确度的方法选择适当的显色剂灵敏度高选择性好显色剂在测定波长处无明显吸收反应生成的有色化合物组成恒定 第四节提高测量灵敏度和准确度的方法 选择合适的测定条件入射光波长的选择显色剂的用量溶液的酸度显色时间和温度空白溶液的选择溶剂空白试剂空白试样空白 共存离子的干扰及其消除控制显色反应的酸度加入掩蔽剂分离干扰离子 第五节紫外分光光度法简介 一 752型分光光度计紫外分光光度法适用测定在近紫外区 200 380nm 有特征吸收的物质 752型分光光度计装有可转换的适用于可见分光光度法的钨灯光源和适用于紫外分光光度法的氢灯光源 发射