Folin-酚试剂法测定蛋白质含量

1 6 Folin 酚试剂法测定蛋白质含量酚试剂法测定蛋白质含量 一 一 实验目的实验目的 掌握 Folin 酚试剂法测定蛋白质含量的原理 操作技术 掌握制作标准曲线的要领 并通过标准曲线求样品溶液中待测定物质含量 提高在严格时间限定下的实验操作能力 二 二 实验原理实验原理 蛋白质分子中酪氨酸可以和色氨酸残基 酚基 还原酚试剂 磷钨酸 磷钼酸 起 蓝色反应 此法由 folin 在 1921 年开创 1951 年 Lowry 对此法进行了改进 先于标本中加碱性铜试剂 再与酚试剂反应 提高了灵敏度 第一步 双缩脲反应第一步 双缩脲反应 在碱性溶液中 双缩脲 H2NOC NH CONH2 能与 Cu2 作用 形成紫色或紫红色的络 合物 即在碱性溶液中 蛋白质分子中的具有双缩脲结构的肽键与碱性铜试剂中的 Cu2 作用生成紫红色的蛋白质 Cu2 复合物 第二步 第二步 Folin Folin 酚显色反应酚显色反应 Folin 酚试剂在碱性条件下极不稳定 其磷钼酸盐 磷钨酸盐易被酚类化合物还原 而呈蓝色反应 钼蓝和钨蓝的混合物 蛋白质 Cu2 复合物中所含的带酚羟基的酪氨 酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸 生成蓝色的化合物 在一定浓度范围内 蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系 故与同样处理的蛋 白质标准液比较即可求出样品中蛋白质的含量 2 6 三 三 实验材料实验材料 一 样品 一 样品 健康人血清 300 倍稀释 正常人血清蛋白质含量 60 80 g L 二 二 试剂试剂 牛血清白蛋白标准液 200 g ml 碱性硫酸铜溶液 Folin 酚试剂 三 三 仪器与器材仪器与器材 V 1100 分光光度计 恒温水浴箱 移液管 2mL 洗耳球 试管 6 支 试管架 加样枪 加样枪架 四 四 实验步骤实验步骤 一 一 操作步骤操作步骤 见表 1 1 表表 1 11 1 folin folin 酚试剂法定量蛋白质实验步骤酚试剂法定量蛋白质实验步骤 步骤操作 1 反应体系取 6 支试管编号 按下表加入试剂 混匀 空白管 标准管 样品管 1 2 3 4 5 6 牛血清白蛋白标准液 0 2 0 4 0 6 0 8 样品液 0 5 蒸馏水 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 5 2 双缩脲反应向各管内分别加入碱性硫酸铜溶液 2 0ml 摇匀 室温放置 10min 3 folin 酚反应向各管加入 folin 酚试剂 0 2ml 2s 内迅速摇匀 40 水浴 10min 后 冷却至室温 试剂 ml 3 6 4 比色测定用 500ml 波长比色 用 1 号管作空白对照 读取各管吸光度值 每 管重复测三次 求平均值用于绘制标准曲线 二 二 注意事项注意事项 1 操作控制 folin 酚试剂加到碱性铜 蛋白质溶液中后 必须立即混匀 使 还原反应发生在磷钼酸 磷钨酸被破坏之前 2 时间控制 因反应显色随时间不断加深 因此各项操作必须精确控制时间 第 1 值试管加入 2 0ml 碱性硫酸铜试剂后 开始计时 1min 后 第 2 支试管再加入 2 0ml 碱性硫酸铜 以此类推 余下试剂的加入步骤和检测中 每支试管间均需严 格执行 1min 钟的时间间隔操作 五 实验结果与分析 1 1 现象与图片记录现象与图片记录 操作操作现象现象 双缩脲反应 各管内分别加入碱 性硫酸铜溶液 2 0ml 摇匀 室温 放置 10min 后 溶液呈无色透明 无明显现象 folin 酚反应初 各管加入 folin 酚试剂 0 2ml 2s 内迅速 摇匀 2 5 号试管溶液变黄色 颜色逐渐加深 6 号试管 黄色深度介于 2 号和 3 号试管之间 将各试管 40 水浴 10min 冷却至 室温 2 5 号试管溶液变蓝色 颜色逐渐加深 6 号试管 蓝色深度介于 2 号与 3 号试管之间 4 6 2 2 数据记录数据记录 按照表按照表 1 11 1 记录各管在记录各管在 500nm500nm 波长测得的吸光度值波长测得的吸光度值 表表 1 21 2 500nm500nm 波长吸光度值记录波长吸光度值记录 各管吸光度值 A500 测定次数 1 2 3 4 5 6 1 2 0 0 127 0 275 0 336 0 465 0 163 0 0 128 0 275 0 336 0 466 0 164 3 0 0 128 0 276 0 336 0 467 0 165 各管平均值 0 0 128 0 275 0 336 0 466 0 164 3 3 绘制标准曲线绘制标准曲线 以 A500为纵坐标 牛血清清蛋白标准液为横坐标 根据所得数据描点连线 所绘制 曲线如下 从图中可以看出线性方程 y 0 003x 将样品溶液的吸光度 即 y 值 代入方程 求得样品浓度为 55 g ml 5 6 4 4 结果计算结果计算 血清蛋白浓度 g ml 样品蛋白质浓度 2 300 55 g ml 2 300 33000 g ml 33g L 本次实验中所测结果为 33g L 相比较正常范围 60 80 g L 结果明显偏低 故认为此次实验并未成功 问题分析如下 5 5 问题分析问题分析 问题问题解析解析 实验所测血清蛋白浓度 偏低 1 洗涤试管后未等试管晾干直接进行实验 导致试管内残 留的蒸馏水稀释了样品液 2 使用加样抢移取样品液时可能少量样品液残留于枪头 3 Folin 酚反应时因实验室拥堵 器材使用受限 导致反 应时间间隔控制不一致 样品液 在第 6 支试管内 反 应时间相对偏过短 6 6 回顾与反思回顾与反思 Folin olin 酚试剂法的优缺点有哪些 酚试剂法的优缺点有哪些 优点 仪器配置要求较低 使用试剂量少 节约资源 灵敏度相比双缩脲试剂法高 缺点 操作步骤多 耗时长 Folin 酚试剂专一性较低 干扰物质多 稳定性差 可能干扰本实验的因素有哪些 要注意些什么 可能干扰本实验的因素有哪些 要注意些什么 干扰因素 所测蛋白质样品若含有酚类及柠檬酸 6