拟南芥基因克隆的策略与途径(DOC 6页).doc

拟南芥基因克隆的策略与途径拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植物的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国政府的重视。基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。1、图位克隆Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed by Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated by this method is based on functional genes in the genome has a relatively stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnormalities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find molecular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms.图位克隆（map-based clonig）又称定位克隆（positoinal cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出。用该方法分离基因是根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，在利用分离群体的遗传连锁分析或染色体异常将基因伫到染色体的1个具体位置的基础上，通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因，并阐明其功能和生化机制。用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了（图1）。 目前完成整个拟南芥的图位克隆过程大约需要一年时间。在这个过程中，我们从筛选突变体开始，逐渐找到和表型相关的基因。这和反向遗传学（reverse genetics）的方法正好相反。图位克隆能实现，关键在于全基因组测序计划的完成和各种分子标记的发现。这些数据被储存在专门的数据库中（表1）（Lukowitz等， 2000）。表1 拟南芥网络资源网站网址Supplemental material for this paper/methods/ppsuppl.htmlNottingham Stock Centre（U.K.）http:/nasc.nott.ac.uk/Recombinant Inbred map http:/nasc.nott.ac.uk/new_ri_map.htmlOhio Stock Center（U.S.A.） /aims/TAIR database*， homepage Recombinant Inbred map（mirror site） /cgi-bin/maps/RiintromapCAPS markers /aboutcaps.htmlSequence table /cgi-bin/maps/Seqtable.plSNP collection /SNPs.htmlCEREON collection of polymorphisms /cereonSSLP markers/SSLP_info/SSLP.htmlTIGR， genome annotations /tdb/athl/htmls/index.htmlDatabase of Ler sequences /tdb/atgenome/Ler.htmlKasuza DNA Research Institute， genome annotations http:/www.kazusa.or.jp/kaos/MIPS genome annotations http:/websvr.mips.biochem.mpg.de/proj/thal/SINS database of transposon insertions http:/www.jic.bbsrc.ac.uk/sainsbury-lab/jonathan-jones/jjhome.htm*注：The Arabidopsis Information Resource （TAIR）在拟南芥中的图位克隆，在很大程度上得益于对Col-0生态型测序的完成，因为它是在研究拟南芥时最常用的生态型。实现基因图位克隆的关键是筛选与目标基因连锁的分子标记。实质上，分子标记是一个特异的DNA片段或能够检出的等位基因，对其有效地利用即可达到图位克隆基因之目的。迄今为止，已有几十种技术可用于分子标记的筛选（Wang等，2000）。其中最为常用的是简单序列长度多态性（SSLPs）和单核苷酸多态性（SNPs）。SSLP是基于PCR的分子标记，在拟南芥基因组中有较多分布，而且是共显性的，它的检测非常直接，但是我们需要设计引物来检测假定的SSLP标记；对SNPs标记的检测也比较直接，它是拟南芥不同生态型之间基因组中的单个核苷酸的差别，这些差别的核苷酸通常位于非编码区域（Peters等， 2003）。最常见的用于检测SNPs标记的方法主要是剪切扩增多态性序列（CAPS），它也是基于PCR的。另外，一种更为有效的方法衍生的CAPS（dCAPS）（Nam等， 1989； Michaels 和 Amasino， 1998）可把任何已知的点突变作为分子标记，只要在PCR是引入不配对的引物，使扩增的序列在一个生态型中具有限制性酶切位点，而在另一生态型中没有，以形成多态性。图位克隆法随着相关配套技术（序列数据库、分子标记等）的日渐成熟，许多拟南芥及一些农作物的基因已被成功的克隆（表2）。表2 用图位克隆方法得到的拟南芥及一些农作物的基因基因突变表型基因同源序列AB13脱落酸不敏感玉米转录子FID3降低亚油酸饱和度细菌去饱和酸酶AXR1生长素抗性泛素N 端活性酶ETR1乙烯抗性双因子调节子ABI1脱落酸不敏感钙调蛋白磷酸化酶DET1黄化损伤反应新核蛋白RPS2抗病新型富含亮氨酸的蛋白酶RPM1抗病激酶RSW1纤维素合成酶细胞色素P450 家系ZLL调节中茎分生细胞胚胎发育蛋白PRT1抑制胞间蛋白降解控制植物N 端代谢Tornadol植株短化IFL1正常的维管束间纤维分化受阻亮氨酸拉链蛋白ARA1树胶醛糖激酶活性丧失半乳糖激酶基因家族VTC2维生素C合成不足果蝇蛋白CG3552，线虫蛋白C10F3.4（功能未知）AST种皮花青苷斑点花青苷生物合成途径中的二氢黄酮醇-4-还原酶本文拟对图位克隆的研究进展做一介绍，以期对植物遗传育种和分子生物学研究有所帮助。2 图位克隆的一般过程因为有了拟南芥的基因组序列和高密度的遗传标记，图位克隆过程就变得相对直接。图2例举了一种高效的拟南芥图位克隆方法。从基于Col-0和Ler遗传背景的突变体出发，我们有可能在大约一年时间内找出与这个突变相关的基因，这其中主要耗时间的是五个植物（拟南芥）的生长周期（我们假定每个周期为两个月）。作为作图过程的第一步，突变体植株将和另外一个生态型（Col-0或者Ler）的植株杂交。在大多数情况下，用于杂交的突变体植株是作为父本还是母本是没有关系的。然后播种F1代种子。在F1代植物的生长过程中，我们就有可能来对其表现型和基因型进行分析。F1代植物的表型的出现或者消失将显示着我们所研究的突变是显性的还是隐性的。最好通过对一些标记的分析来确认F1代植物是杂合体，而且在杂交过程中我们没有犯错误。当然也有必要确认原来的生态型背景。图2 图位克隆过程示意图（Jander等， 2002）F1代植物自交得到F2代种子，大约播种600个个体以进行突变基因的粗定位（first-pass mapping，图2）。在其生长过程中，我们可确定其表型，大约有150个个体被认为是纯合体（在隐性突变的情况下是纯合突变体，在显性突变的情况下是纯合野生型）。然后从这150个个体的叶子或者其它组织中制备DNA用于基因型分析。起先用分布于拟南芥五条染色体上的25个标记（相邻的两个标记之间大约相距20 cM）进行分析，确定突变基因是和哪个或者哪几个标记是连锁的，然后用三点测交的方法来定义一个包含突变基因的大约20 cM的遗传间隔。一旦这样的一个遗传间隔被定义之后，接下来的工作就是引入新的标记把这个间隔缩小到大约4 cM。一般来说，利用150个F2代个体是在很大程度上能找到这样一个遗传间隔的，距离突变基因最近的两个分子标记将作为侧面标记而用于下面的进一步分析。下一步我们将播种一个更大的F2代群体用于突变基因的精细定位（fine-resolution mapping，图2）。最终目标是将包含突变基因的遗传间隔缩小到40 Kb甚至更小（这在拟南芥中大约是0.16 cM）。显然用于作图的F2代植物越多，就越能精确地定位突变基因。一般需要30004000个F2代植物个体（包括粗定位时的600个F2代植物个体）来精确地定位突变基因。但是也有很多图位克隆过程用了少于3000个F2代植物个体就成功地定位了突变基因（Lukowitz等， 2000）。但是这往往要冒因为作图群体不够大再一次种植F2代植物而延长整个作图过程的时间的风险。在这个大约4 cM的遗传间隔内找到与突变更紧密连锁的分子标记，一般情况下能在突变两侧找到相距小于40 Kb的两个分子标记。一旦这样的两个分子标记被找到之后，就可以通过测序来找到突变基因。一种有效的方法是设计PCR引物来扩增覆盖这40 Kb的多个重叠的500 bp的片段。将这些片段测序后拼接起来以得到整个40 Kb的序列，然后将它与野生型植物（Col-0或者Ler）的序列进行比对，这就可以找到这个区域中的多个基因。从一系列侯选基因中鉴定基因是定位克隆技术的最后一个关键环节。现在最常用的方法是用含有目标基因的大片段克隆如BAC克隆或YAC克隆去筛选cDNA文库，并查询生物数据信息库，待找出侯选基因后，把这些侯选基因进行下列分析以确定目标基因：（1）精确定位法检查cDNA是否与目标基因共分离；（2）检查cDNA时空表达特点是否与表型一致；（3）测定cDNA序列，查询数据库，以了解该基因的功能；（4）筛选突变体文库，找出DNA序列上的变化及与功能的关系；（5）进行功能互补实验，通过转化突变体观察突变体表型是否恢复正常或发生预期的表型变化。功能互补实验是最直接、最终鉴定基因的方法。利用新兴的RNA干扰（RNAi）也可有效地确定目的基因。同源克隆：生物的种、属之间编码基因序列的同源性高于非编码区的序列，基于此原理，在其他种属同源基因被克隆的前提下，构建cDNA文库或基因组文库，然后用已知分子高保守序列制备同源探针，经标记后从相应的文库中筛选阳性克隆，并经核酸序列分析鉴定所克隆的基因，当然在没有全同源探针的情况下，可以使用部分同源探针来筛选与探针序列相关但不完全相同的基因。图位克隆同源克隆转座子标签 表达序列标签(expressed sequence tags, EST)是从一个随机选择的cDNA克隆进行5端和3端单一次测序获得的短的cDNA部分序列, 代表一个完整基因的一部分。DbEST，database EST 表达序列标签数据库。1951年Barbara Mclintock首先在玉米中发现了控制元件，后来命名为转座元件或转座子(transposon)。转座子是基因组中一段可移动的DNA序列，可以通过切割、重新整合等一系列过程从基因组的一个位置“跳跃”到另一个位置。这一元件不仅可用于分析生物遗传进化上分子作用引起的一些现象，还为基因工程和分子生物学研究提供了强有力的工具，可以在不了解基因产物的生化性质和表达模式的情况下，分离克隆植物基因，即转座子标签(transposon tagging)，又称为转座子示踪法。其原理是利用转座子的插入造成基因突变，以转座子序列为基础，从突变株的基因文库中筛选出带有此转座子的克隆，它必定含有与转座子序列相邻的突变基因的部分序列，再利用这部分序列从野生型基因文库中获得完整的基因1。1984年，用转座子标签法首先在玉米中分离了bronze基因，该基因编码了玉米花色素合成途径的关键酶UDP-葡萄糖类黄3-O-葡萄糖基转移酶2。此后还利用转座子标签技术分离了许多植物基因。 转座子可以分为两大类：以DNA-DNA方式转座的转座子和反转录转座子(retr