微生物药物学-第二十三章-生物转化技术在现代医药中应用

第二十三章生物转化技术在现代制药工业中的应用 第一节生物转化与手性药物合成第二节生物转化与手性中间体的制备第三节生物转化技术在现代制药工业中的应用第四节生物转化技术在其他相关产品中的应用 第一节生物转化与手性药物合成 生物催化剂为高度手性催化剂 催化反应效率高 立体选择性好 反应产物对映体过量率 e e 有时可达100 生物催化法是实现手性合成的有效途径 而很多药物的药理活性与毒性与药物手征性结构密切相关 利用生物转化技术制备手性药物 关键中间体 的一些实例 一 有关手性合成的几个基本概念 1 手性或手征性 chiral或chirality 所谓手征性是指实物与其镜像不能相互重合的性质 如同人的左手和右手的关系 互为镜像 但不能重合 判断分子是否具有手征性 必须考虑它缺少哪些对称因素 通常只要一个分子既没有对称面又没有对称中心时 就可以断定它是手征性分子 造成分子有手征性的一个最通常的因素是含有手性碳原子 常用 C表示 即和四个不同原子或基团相连的碳原子 2 手性药物 chiraldrug 所谓手性药物是指单一异构体药物 近年来人们对手性药物愈来愈关注的重要原因是它们的治疗活性主要存在于一种异构体 而另一 些 异构体或是无活性的 或是具有不同的药理活性 甚至有严重的毒副作用 3 对映体 对映异构体 enantiomer 具有一定构造的分子 其原子在空间的排列方式可能不止一种 即可能存在不止一种构型 凡是手性分子 必有互为镜像的构型 这种互为镜像的两种构型叫做对映体 分子的手性是对映体存在的必要和充分的条件 一对对映体的构造相同 只是立体结构不同 因此它们是立体异构体 这种立体异构体就叫做对映异构体 3 对映体 对映异构体 enantiomer 对映异构和顺反异构一样都是构型异构 要把一种异构体变成构型异构体 必须断裂分子中的两个键 然后对换两个基团的空间位置 而构象异构则不同 只要通过键的扭转 一种构象异构体就可以转变为另一种构象异构体 4 立体异构体 stereoisomer 其分子由相同数目和相同类型的原子组成 是具有相同的连接方式但原子的空间排列方式不同 即构型不同的化合物 5 非对映异构体 diastereoisomer 具有二个或多个非对称中心 且其分子相互不为镜像的立体异构体 如D 赤鲜糖和D 苏糖常简称为 非对映体 6 不对称合成 手性合成 asymmetricsynthesis chiralsynthesis 不对称合成常常也被称之为手性合成 最初的定义为 不对称合成是一个用纯手性试剂通过非手性底物的反应形成光学活性化合物 opticallyactivecompound 的过程 即从一个具有对称构造的化合物产生光学活性物质的反应过程 6 不对称合成 手性合成 asymmetricsynthesis chiralsynthesis 更为广义的不对称合成的定义为 一个反应 其中底物分子整体中的非手性单元由反应剂以不等量地生成立体异构产物的途径转化为手性单元 也就是说 不对称合成是一个过程 它将潜手性 prochiral 单元转化为手性单元 使得产生不等量的立体异构产物 一个成功的不对称反应的标准 1 高的对映体过量 e e 2 用于不对称反应的反应剂应易于制备并能循环使用 3 可以制备得到R和S两种构型 4 最好是催化性的合成 迄今 能完成最好的不对称合成的反应剂可以认为是生物催化剂 即自然界中的微生物和酶 7 不对称放大 手性合成子和手性助剂 asymmetricamplification chiralsynthon chiralauxiliary 不对称放大是指应用一种具较低对映体纯度的催化剂或试剂制备具较高对映体纯度的产物的过程 手性合成子为一单对映体化合物 以其作为起始原料在反应过程中诱导产生所需的手性化合物 手性助剂为一单对映体化合物 其通过共价键与底物暂时结合 在反应过程中诱导出手性 最后再使共价键断开得到单对映体产物 并回收助剂 8 外消旋 内消旋和外消旋化 racemic meso racemization 外消旋是指一种物质以两种互为对映体的手性分子的等量混合物形式存在的现象 这种物质即为外消旋体 外消旋体也称为外消旋混合物 racemicmixture 或外消旋物 racemate 其化合物名称前用dl 不鼓励使用 或 符号 较好 或用前缀rac表示 8 外消旋 内消旋和外消旋化 racemic meso racemization 内消旋是指一种物质的分子内具有2个或多个非对称中心但又有对称面 因而不能以对映体存在的现象 这种物质即为内消旋体 其化合物用前缀meso表示 外消旋化是指一种对映体转化为两个对映体的等量化合物 内消旋体和外消旋体都没有旋光性 但它们在本质上是不同的 9 光学 旋光 活性 光学 旋光 异构体和光学纯度 opticallyactive opticalisomer opticalpurity 光学活性是指由实验观察到的一种物质将单色平面偏振光的平面向观察者的右边或左边旋转的性质 通常用 表示右旋 用 表示左旋 光学异构体即为对映体的同义词 现已不常用 因为一些对映体在某些光波长下并无光学活性 光学纯度是指根据实验测定的旋光度 在两个对映混合物中一个对映体所占的百分数 10 立体选择性反应和立体专一性反应 stereoselectivereaction stereospeceficreaction 如果一个反应不管反应物的立体化学如何 生成的产物只有一种立体异构体 或有两种立体异构体时 其中一种异构体占压倒优势 这样的反应被称之为立体选择性反应 从立体化学上有差别的反应物给出立体化学上有差别的产物的反应被称之为立体专一性反应 所有的立体专一性反应必定是立体选择性反应 但不是所有的立体选择性反应必定是立体专一性反应 因为有些反应物是没有立体结构特征 而生成物是有立体结构特征的 11 对映体过量 enantiomericexcess 简称e e 和对映选择性 enantioselectivity 对映体过量 e e 是指在两个对映体混合物中 一个对映体E1过量的百分数 即e e E1 E2 E1 E2 100 对映选择性是指一个化学反应 包括生物反应等 产生一种对映体多于相对对映体的程度 12 D L R S和d l D L为分子的绝对构型 按照与参照化合物D 或L 甘油醛的绝对构型的实验化学关联而指定 D L标记法应用已久 也比较方便 但是这种标记只能表示出分子中一个手性碳原子的构型 对于含有多个手性碳原子的化合物不合适 有时甚至会产生名称上的混乱 因此 其仅常用于一些常见的和天然的氨基酸或糖 对其它一些化合物目前都采用R S来表示 12 D L R S和d l R S标记法是根据手性碳原子所连接的四个基团的排列顺序来标记手性碳原子构型的一种方法 因此 在化学反应中 如果手性碳原子构型保持不变 产物的构型与反应物的相同 但其 R 或 S 标记却不一定与反应物相同 反之 如果反应后手性碳原子的构型转化了 产物构型的 R 或 S 也不一定与反应物相同 因为经过化学反应 产物的手性碳上所连接的基团与反应物的不一样了 产物和反应物的相应基团的排列次序可能相同也可能不同 R 或 S 的标记 决定于它本身四个基团的排列次序 而与反应时的构型是否保持不变无关 12 D L R S和d l d或l是指物质右旋或左旋 是按照实验测定的将单色平面偏振光的平面向右或向左旋转而定 目前常用 表示右旋 用 表示左旋 13 拆分 resolution 拆分是指将外消旋体分离成旋光体的过程 外消旋体是有一对对映体等量混合而成 对映体除旋光方向相反外 其它物理性质都相同 因此 虽然外消旋体为两种化合物的混合物 但用一般的物理方法 如蒸馏 重结晶等不能把一对对映体分离开来 必须用特殊的方法才能把它们拆开 目前常用的一些方法包括有以下几种 化学拆分法 这个方法应用最广 其原理是将对映体转变为非对映体 然后分离 外消旋体与无旋光性的物质作用并结合后 仍是外消旋体 但是若使外消旋体与旋光性物质作用并结合后 则原来的一对对映体变成了两种互不对映的衍生物 于是外消旋体变成了非对映体的化合物 非对映体具有不同的物理性质 可以用一般的分离方法把它们分开 最后再把分离所得的两种衍生物分别变回原来的旋光物质 即达到了拆分的目的 这种拆分法最适合于酸或碱的外消旋体的拆分 目前已经开发了许多光学异构体分离用的介质 生物拆分法 某些微生物或它们所产生的酶 对于对映体中的一种异构体有选择性的分解作用 利用微生物或酶的这种性质可以从外消旋体中把一种旋光体拆分出来 但在拆分过程中 外消旋体至少有一半被消耗掉了 诱导结晶拆分法 在外消旋体的过饱和溶液中 假如一定量的一种旋光体的纯晶体作为晶种 由于溶液中这种旋光体的含量较高 且在晶种的诱导下优先结晶析出 将这种结晶滤出后 则另一种旋光体在滤液中相对较多 再加入外消旋体制成过饱和溶液 于是另一种旋光体优先结晶析出 如此反复进行结晶 就可以把一对对映体完全分开 选择吸附拆分法 用某种旋光物质作为吸附剂 使之选择性地吸附外消旋体中的一种异构体 以达到拆分的目的 近年来开发用于分离光学异构体的拟移动床色谱就是根据这种原理设计的 逆流萃取拆分法 在萃取液中使用合适的手性助剂 以逆流萃取的方法可以使外消旋体混合物对映体得到分离 其它拆分法 近年来正在不断开发各种新的对映体拆分技术包括所应用的设备的开发 14 外消旋体转换 racemicswitch 即从已知的外消旋体药物开发单一异构体药物 这对该品种的原开发商而言可籍此延长产品的专利保护期 对其它厂商而言是一条获得新产品的捷径 因为其相对风险小投入少 二 开发手性药物的意义 美国FDA于1992年公布了手性药物指导原则称 制药厂商必须确定外消旋体及各立体异构体的特性 作用效果 质量 纯度 比较各异构体的体外系统和 或 人体中的药理活性 如异构体之间药物动力学特性有差异的需分别测定相关的数据 二 开发手性药物的意义 另外 鼓励开发已经上市的外消旋体药物的单一异构体 即如果发现单一异构体的疗效提高 副作用减轻或具有新的药理作用 就可以扩大适应症范围 并可望延长专利保护期 FDA还正在考虑给此类单一异构体部分以新化学实体的待遇 享受一定期限的市场独占权 市售的单一异构体和外消旋体药物 二 开发手性药物的意义 药物的手征性问题在制药工业界愈来愈受到重视 对单一异构体药物 即俗称为手性药物的关注有许多理由 最重要的一点是药物的作用靶点 生物体的酶和细胞表面受体是手性的 外消旋体药物的两个对映体在体内以不同的途径被吸收 活化或降解后 就与具有不同手征性特性的靶点结合 从而出现这两种对应体可能有相同的药理活性 或者是一种可能是活性的 另一种可能是无活性的甚至是有毒性的 或者是两者可能有不同程度或不同性质的活性 些药物或化合物异构体的不同药理活性或其它特性 二 开发手性药物的意义 在生物体系中 立体异构识别是很明显的 一般就手性化合物而言 可能有四种不同的生物学效应 只有一种异构体具有所希望的生物活性 而另一种没有显著的所希望的生物活性 只有一种异构体具有所希望的生物活性 而另一种不具有所希望的生物活性 只有一种异构体具有所希望的生物活性 而另一种具有不希望的生物活性 两种异构体具有不同药理作用的生物活性 引起对对映体可能表现有不同的药理作用或毒副作用关注的原因 可以从在20世纪60年代欧洲发生的一个悲剧来说明 即外消旋的沙利度胺曾是有力的镇静剂和止吐药 尤其适合在早期妊娠反应中使用 不幸的是 有些曾服用这种药的孕妇产下了畸形的婴儿 因此 很快就发现它是极强烈的致畸剂 进一步的研究表明 其致畸作用是由该药的 S 异构体所引起的 而 R 异构体被认为即使在高剂量时在动物中也不会引起畸变 引起对对映体可能表现有不同的药理作用或毒副作用关注的原因 另外一个有趣的例子是治疗帕金森氏病的L 多巴 DOPA 在体内的活性形式是通过脱羧作用形成无手征性的多巴胺 但由于多巴胺不能跨越 血脑屏障 进入作用部位 因而必须服用前药L 多巴 再由体内的酶将其催化脱羧形成活性态的多巴胺 然而 多巴脱羧酶是专一性的 只对L 多巴的 对映体发生脱羧作用 因此 必须服用L 多巴 否则 L 多巴可能会在体内积聚而发生危险 目前 通过使用一系列不对称合成方法 可以工业规模制备L 多巴 沙利度胺和L 多巴的异构体结构 一些处于不同阶段从外消旋体转换为单一异构体药物的开发状况 第二节生物转化与手性中间体的制备 手性药物制备的关键技术是不对称合成 asymmetricsynthesis 技术 多年来 有机化学工作者已经研究开发了许多种用化学的方法进行不对称合成的技术 但近20多年来 很多长期从事化学合成研究的工作者对微生物和酶反应发生了兴趣 与此同时 很多长期从事微生物和酶的研究的工作者对如何将此应用于有机合成发生了兴趣 从而使生物催化转化 biocatalytictransformation 成为一种进行不对称合成的重要技术 应用生物催化转化技术进行不对称合成与化学合成法相比较具有的优越性有 1 转化底物某一基团的专一性强 即对不需要转化的基团无需保护 2 通过对用于某一转化的微生物进行菌种选育和转化条件的优化 可以得到极高的转化率 3 生物催化转化的反应条件温和且对环境的污染很小 特别是近年来DNA重组技术的应用和新的转化系统的开发应用 使愈来愈多的原来使用化学方法进行不对称合成的化合物有可能被生物催化转化的方法来替代 一 三元环和四元环中间体的制备 环氧乙烷的生物拆分和frontalin以及baclofen的合成 二 五元环中间体的制备 逆狄尔斯 阿尔德反应和海人藻酸的合成 三 六元环中间体的制备 C2不对称化合物12的酶拆分过程 四 七元环中间体的制备 对映体纯化合物 26和 26的合成 第三节生物转化在现代制药工业中的应用 一 钙离子拮抗剂 抗心绞痛和高血压药地尔硫卓关键中间体的制备利用来源于S marcescens的脂肪酶拆分 2RS 3SR 3 4 甲氧基苯基 缩水甘油酸甲酯 能够得到纯度很高的 2R 3S 4 甲氧苯基缩水甘油酸甲酯 其对映体过剩率e e值高达98 以上 理论转化率为50 自从1993年以来 日本Tanabe公司每年生产50吨这样的关键中间体 用于制备抗心绞痛和高血压药 图所示为用脂肪酶制备关键中间体 2R 3S 4 甲氧苯基缩水甘油酸甲酯的路线 利用脂肪酶拆分外消旋体对甲氧基苯苷氨酰甲酯制备地尔硫关键中间体 二 农药FRONTIER的关键中间体的制备 另外一个利用微生物来源脂肪酶实现工业化制备药物关键中间体的实例是 BASFAG公司利用假单胞菌DSM8246脂肪酶制备农药FRONTIER的关键中间体 S 1 甲氧基 2 氨基丙烷 其不需要的对映体可以被外消旋化后循环拆分 由于动力学拆分的最大转化率为50 因此 通过选择不同的溶剂系统研究原位外消旋化技术非常重要 图所示为利用脂肪酶制备关键中间体 S 1 甲氧基 2 氨基丙烷的路线 利用脂肪酶制备农药FRONTIER关键中间体 S 1 甲氧基 2 氨基丙烷 目前正在研究的一种杀虫剂关键中间体 S 4 羟基 3 甲基 prop 2 ynyl cyclopent 2 enone也是通过脂肪酶催化获得的 三 免疫抑制剂脱氧精胍菌素关键中间体的制备 抗肿瘤抗生素精胍菌素 spergualin 首先从微生物发酵液中发现 在用全合成方法制备精胍菌素时 用酸催化的缩合反应导致产生C 11两个对映体 用合成方法得到的外消旋体精胍菌素的抗肿瘤活性仅为微生物来源的一半 提示C 11位构型的重要性 免疫抑制剂15 脱氧精胍菌素 15 deoxyspergualin 合成的关键中间体 S 乙酸酯 可以用来源于假单胞菌的脂肪酶对其相应的外消旋体进行对映体选择性酰化得到 该反应可在甲基乙基酮系统中进行 假单胞菌脂肪酶AK为生物催化剂 醋酸乙烯酯为酰化剂 目的产物S 乙酸酯的转化率为48 理论最大值为50 对映体过剩率为98 不需要的醇转化率为41 对映体过剩率为98 5 15 脱氧精胍菌素 15 脱氧精胍菌素的化学结构及其关键中间体S 乙酸酯的制备路线 四 选择性 3 受体激动剂关键中间体的制备 选择性 3 受体激动剂可以用来治疗胃肠道疾病 II型糖尿病和肥胖症等 合成如图所示的 3 受体激动剂时所用的单一构型的关键中间体 S 单酯化合物可以通过猪肝酯酶水解甲基 4 甲氧苯基 丙二酸二乙酯获得 如图所示 当用乙醇作为反应助溶剂 在双相系统中温度为10 时 其 S 单酯化合物转化率可达到96 7 对映体过剩率可达到96 3受体激动剂 3 受体激动剂的化学结构及其关键中间体 S 单酯化合物的制备路线 五 2 受体激动剂 支气管扩张药物 R R 福莫特罗中间体的制备 目前临床应用的 2 受体激动剂 支气管扩张药物福莫特罗 formoterol 为外消旋体 最近的研究表明 不同的异构体其药理活性不同 R R 立体异构体具有正常的药理作用 应用酶促拆分的方法可以获得制备 R R 福莫特罗的关键中间体 用洋葱假单胞菌脂肪酶PS 30酶促酰化外消旋体醇化合物12 得到酰化产物 S 13和期望的未反应产物 R 11 得率为46 用Candidaantarctica脂肪酶拆分外消旋体化合物14 得到期望的产物 R 15和未反应的产物 S 16 R 15的反应总收率为11 对映体过剩率为96 当在反应过程中加入0 15当量的三乙胺时 反应至4小时时能够得到42 的转化率和94 的 经过水解和层析分离 其收率为21 对映体过剩率为94 最后 通过化学反应 将关键中间体 R 11和 R 15缩合 得到终产物 R R 福莫特罗 R R 福莫特罗的制备路线 六 抗Alzheimer s药物关键中间体的制备 S 2 戊醇是多个研究中的抗Alzheimer s药物 抑制 淀粉状蛋白的释放和 或合成 的关键中间体 利用Candidaantarctica脂肪酶B拆分外消旋体2 戊醇和2 庚醇 能够得到这一关键中间体 该酶能够有效地催化这一反应 转化率为49 理论最大转化率为50 对映体过剩率为99 在这个反应系统中 琥珀酸酐为最合适的酰化剂 2 戊醇既是反应底物 同时也是反应溶剂 图所示为利用Candidaantarctica脂肪酶B制备关键中间体S 2 戊醇和S 2 庚醇的路线 抗Alzheimer s药物关键中间体S 2 戊醇和S 2 庚醇的制备路线 七 具有降胆固醇作用的鲨烯合成酶抑制剂关键手性中间体 BMS188494是一个正在研究开发中的鲨烯合成酶抑制剂 在该药物的化学合成过程中 需要有关键手性中间体S 二乙酯化合物 利用Geotrichumcandidum脂肪酶 在甲苯溶剂中以异丙烯醋酸酯为酰化剂 催化外消旋体二乙酯化合物67获得该关键中间体 其转化率为38 理论最大转化率为50 对映体过剩率为95 图所示为BMS188494的化学结构以及酶促制备关键手性中间体S 二乙酯化合物的路线 鲨烯合成酶抑制剂BMS188494关键手性中间体S 二乙酯化合物的制备路线 八 抗肿瘤药物紫杉醇关键中间体的制备 紫杉醇是目前唯一已知能够抑制微管蛋白解聚过程的多环二萜类药物 天然的紫杉醇从yewbark中分离获得 但其产率很低 1公斤紫杉醇需要大约2磅的yewbark 约3000棵树 用半合成的方法制备紫杉醇是最近几年研究的一个热点 其中用酶促方法制备C 13手性侧链取得了一定的进展 利用来源于洋葱假单胞菌的脂肪酶PS 300以及来源于假单胞菌SC13856的脂肪酶BMS 能够对映体选择性地水解外消旋体醋酸酯cis 3 乙酰氧 4 苯基 2 杂氮环二酮73 至相应的 S 醇74和所期望未反应的 R 醋酸酯75 后者的转化率为大于48 理论最大转化率为50 对映体过剩率大于99 5 用化学方法还原 R 醋酸酯75 就可以得到C 13关键手性中间体 R 醇化合物 紫杉醇C 13关键手性中间体 R 醇化合物的制备路线 九 法尼基合成酶抑制剂关键中间体的制备 法尼基转移酶抑制剂 法尼基合成酶抑制剂关键中间体 R 77化合物的制备路线 十 生物转化与青霉素和头孢菌素母核及有关产品的制备 青霉素母核6 APA和半合成产品氨苄青霉素制备过程 十 生物转化与青霉素和头孢菌素母核及有关产品的制备 头孢菌素母核7 ADCA和半合成产品头孢氨苄的制备过程 十一 生物转化HMG CoA还原酶抑制剂普伐他汀的制备 十二 克拉红霉素的生物转化 克拉红霉素为6 O 甲基红霉素 目前已经通过多种化学合成途径 实现了产业化 但由于在红霉素分子结构中存在有多个羟基 因此 为了能够在6 OH的羟基上进行甲基化 需要对C 9位的酮基和糖分子中的多个羟基进行保护 然后再进行脱保护反应 整个反应步骤冗长 且环境污染大制造成本高 十二 克拉红霉素的生物转化 N 取代 1 脱氧野尻霉素的合成方法一 十三 糖苷酶抑制剂米格列醇和伏格列波糖的生物转化 一 利用生物转化技术制备米格列醇关键中间体的主要方法 十三 糖苷酶抑制剂米格列醇和伏格列波糖的生物转化 一 利用生物转化技术制备米格列醇关键中间体的主要方法 N 取代 1 脱氧野尻霉素的合成方法二 N 取代 1 脱氧野尻霉素的合成方法三 方法三具有的优点 1 转化液经离心除去菌体 无需分离纯化出中间体 就可进行下一步合成 2 无需基团保护 成本大大降低 且避免因去除保护剂而造成的回收率下降 3 中间体6 取代胺基 6 脱氧 L sorbofuranose具有较高的溶解度和稳定性 不易被降解 二 利用生物转化技术制备伏格列波糖关键中间体的方法 十四 抗高血压药物Omapatrilatt的生物转化 第一种方法 利用牛肝谷氨酸脱氢酶将2 keto 6 hydroxyhexanoicacid 化合物3 还原胺化为L 6 hydroxynorleucine 化合物2 第二种方法 为了避免上述制备2 酮酸化学合成的过程太长 利用来自于猪肾或Trigonopisvariabillis的D 氨基酸氧化酶处理外销旋的6 hydroxynorleucine 利用生物转化方法将化合物6转化为化合物5的过程 利用L 赖氨酸 氨基转移酶生物转化二肽化合物BMS 201391 01至产物BMS 199541 01的过程 第四节生物转化在其他有关工业中的应用 一 生物转化与单一构型氨基酸的制备 一 生物转化与L 型氨基酸制备 目前工业规模制备各种L 型氨基酸的方法 二 生物转化与D 型氨基酸的制备 最近 日本学者在多种微生物中发现了一种新型的D 脱氨基甲酰酶 N 氨基甲酰 D 氨基酸酰胺水解酶 这种酶能够立体专一性地水解N 氨基甲酰 D 氨基酸 如Blastobactersp A17p 4能够同时产生D 脱氨基甲酰酶和D 乙内酰脲酶 因此 用这二步酶促反应有可能将DL 5 p 羟基苯基 乙内酰脲进行立体专一性地水解 以及随之水解D 氨基甲酰衍生物至D p 羟基苯甘氨酸 从DL 5 p 羟基苯基 乙内酰脲生产D p 羟基苯甘氨酸的化学和酶促过程 涉及到乙内酰脲水解反应的有关酶的作用过程 N 氨基甲酰氨基酸水解酶 脱氨基甲酰酶 的催化反应 利用乙内酰脲酶和脱氨基甲酰酶制备光学活性氨基酸的各种过程 D 型泛酸盐的生物转化 泛酸为人和动物体内代谢过程中携带活化酰基的载体 表所示为代谢过程中一些重要的活化载体 是辅酶A生物合成的直接前体 其生物合成途径见图所示 与植物和微生物不同 人和动物必须通过食物摄入泛酸而不能在体内合成 因此 泛酸作为维生素类药物被广泛用于临床和作为饲料添加剂用于动物的饲养 目前世界上用