植物细胞工程制药

第五章植物细胞工程 白菜甘蓝 一 细胞工程 1概念 2分类 植物细胞工程和动物细胞工程 植物细胞工程 以植物组织细胞为基本单位 在细胞或细胞器水平上应用细胞生物学 分子生物学等理论和技术 在离体条件下进行培养 繁殖或人为的精细操作 使细胞的某些生物学特性按人们的意愿发生改变 从而改良品种或创造新物种 或加速繁殖植物个体 或获得有用物质的过程 它是在植物组织培养的基础上发展起来的 因此植物细胞工程也是广义概念上的植物组织培养 所采用技术的理论基础 植物细胞工程 通常采用的技术手段 植物组织培养 植物体细胞杂交 植物细胞的全能性 一 种苗脱毒茎尖培养可以得到无病毒苗木已成为解决病毒病危害和品种退化问题的一个重要途径 二 植物细胞工程的主要应用 二 快速繁殖许多植物名贵是因为繁殖系数太低 种子结实率低或者不结种子 而营养繁殖又很慢 利用组织培养再生植株 进行大量繁殖 可以大大提高繁殖系数 目前组织培养快速繁殖已在许多植物上应用 最早是兰花 60年代 快速繁殖实现工厂化育苗 特点 繁殖快 性状稳定 整齐一致 无病虫害 周期短 周年生产 三 植物细胞工程育种1 利用培养变异 筛选优良突变体植物离体培养 能够明显提高突变率 并且会有各种各样的生理和形态突变 如株高 花色 植株形态 生育期 耐性等 可以从中选择优良突变体 培育新品种 2 利用远缘杂交幼胚培养 获得杂种植株 克服其杂交不亲和性有些植物远缘杂交 能正常受精 但受精胚往往败育 这种情况下 可以将幼胚在败育前进行离体培养可以使难度很大的远缘杂交取得成功 获得缘远杂种植株 从而育成一些罕见的新物种 3 利用细胞融合技术 克服远缘杂交不亲和性野生种往往有许多优良性状 但大部分与栽培种杂交不亲和 严重影响了野生种优良遗传基因的应用 利用细胞融合 可以克服这种杂交不亲和性 获得体细胞杂种 使野生种的利用成为可能 4 倍性育种 缩短育种年限 5 基因工程基因工程主要研究DNA的转导 而基因转导后必须通过组织培养途径才能实现植株再生 RegenerationofPlantsfromCellsorTissueIsanImportantResearchTool ThisisthemostcommonwayofproducingtransgenicArabidopsis 四 离体种质保存随着地球不断开发 生态环境破坏 种植资源日趋枯竭 大量有用基因损失 利用组织培养法 低温保存 196 或试管保存 为保存和抢救濒临灭绝的生物带来希望 五 细胞培养生产有用物质 生物制品 利用细胞培养生产次生物质 如药物 色素 食品添加剂 酶 农药等 有些极其昂贵的生物制品 如抗癌首选药物 紫杉醇等 可以用大规模培养植物细胞来直接生产 第一节基本概念 1 植物细胞的全能性 植物体中任何一个具有完整细胞核 完整染色体组 的细胞 在一定条件下都可以重新再分化形成原来的个体 2 植物组织和器官培养 在无菌和人工控制条件下 培养基 光照 温度等 研究植物的细胞 组织和器官以及控制其生长发育的技术 3 植物的分化 高等植物的分化分为胚胎发生和器官发生两个阶段 4 脱分化 已经分化的细胞 组织和器官在人工培养的条件下又变成未分化的细胞和组织的过程 5 再分化 通过脱分化诱导形成的愈伤组织在适宜的培养条件下可再分化成为胚状体或直接分化成器官 9 外植体 在植物组织培养过程中 接种在培养基上的无菌细胞 组织 器官等均称为外植体 6 植物无菌培养愈伤组织 愈伤组织是指从植物受伤部位或组织培养物产生的由分化和未分化细胞组成的一类薄壁组织 7 细胞培养8 分生组织培养 10 无性繁殖系 11 突变体 12 继代培养 13 次级代谢作用和次级代谢产物生物碱 黄酮体 萜类等有明显的生理活性 第二节植物细胞工程发展历史 探索阶段 20世纪初至30年代中 植物的器官和组织可以不断分割 直至分到单个细胞而不影响细胞增殖的观点 并设想离体细胞具有再生完整植株的潜力 1902年 德国植物学家Haberlandt提出了植物细胞全能性学说 作为一门技术 必须具有一定的程序性 技术模式 在这一阶段植物组织培养建立了2个与培养技术有关的重要模式 培养基模式 激素调控模式 2 培养技术建立阶段 20世纪30年代至50年代末 1934年美国的White 利用番茄根建立了第一个活跃生长的无性繁殖系 发现B族维生素对培养的离体根生长具有重要作用 创立了White培养基 1943年White发表了 植物组织培养手册 的专著 使植物组织培养开始成为一门新兴的学科 P R White 1948年 Skoog和崔徵通过对烟草茎切段和髓培养组织的研究 确定了腺嘌呤 生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一 1956年Miller等发现了激动素 控制器官分化的激素模式变为激动素 生长素的比例关系 促进组培发展 F Skoog 1958年 英国科学家Steward等用胡萝卜根的愈伤组织细胞进行悬浮培养 成功诱导出胚状体并分化为完整的小植株 首次获得植株再生成功 使细胞全能性理论得到证实 这是植物组培的第一次突破 EdwardC Cocking 1960年 Cocking等用真菌纤维素酶分离植物原生质体获得成功 这是植物组织培养的第二次突破 1960年G Morel采用兰花的茎尖培养 实现了去病毒和快速繁殖两个目的 这是经过茎尖 原球茎 小植株的方式而再生的 G Morel Morel提出的这种离体无性繁殖方法 其繁殖系数极高 很快被兰花生产者所采用 迅速建立起兰花工业 植物离体微繁技术及脱毒技术得到了迅速发展 实现了产业化 1962年Marshing和Skoog在烟草培养中筛选出至今仍被广泛使用的MS培养基 1964年 印度科学家Guha和Maheswari在曼陀罗花药培养中首次由花粉诱导得到了单倍体植株 1971年 Takebe等从烟草原生质体得到再生植株 首次获得原生质体植株再生成功 1972年 Carlson等通过两个烟草物种之间原生质体的融合 获得了第一个体细胞杂种植株 3 应用研究阶段 20世纪70年代以后 1 原生质体培养取得重大突破 2 花药培养取得显著成绩 3 微繁技术广泛应用 第三节植物细胞的形态及生理特性 一 植物细胞的形态 细胞大小不一 基本组织细胞体积较大直径在20 100微米之间 储藏组织细胞的直径可达1毫米 最长的细胞是无节乳管长达数米至数十米 多细胞植物其细胞形态多种多样 球形 类圆形 椭圆形 角形 具有支持作用的细胞细胞壁常增厚 类圆形 纺锤形 具有输导作用的细胞管形 二 植物细胞的结构特征 细胞壁细胞质内质网高尔基体线粒体叶绿体等 细胞核液泡 1 生理活性物质一类对细胞内的生化反应和生理活动起调节作用的物质的总称 包括酶 维生素 植物激素 抗生素和植物杀菌素等 2 后含物植物细胞储藏的物质或者废弃物质 包括生物碱 苷类 有机酸 挥发油等 三 植物细胞主要生理活性物质及其他化学组分 二植物培养细胞的生理特性 1 细胞个体较大 较微生物细胞大得多 有纤维细胞壁 细胞抗剪切力差 2 细胞生长速度较慢 容易被微生物污染 培养时需添加抗生素 3 细胞培养过程中易聚集成团 较难进行悬浮培养 4 培养时需供养 但培养液粘度较大 不能耐受强力通风搅拌 5 细胞培养产物滞留于细胞内 产量低 6 植物细胞具有结构和功能全能性 即培养的细胞可以分化成完整的植株 第四节植物细胞培养的基本技术 一 植物材料的准备1 外植体的选择 1 遗传表型选择 2 生理状态的选择 3 取外植体的部位 4 取外植体的季节和时间 5 外植体大小与诱导成功率 2 外植体的灭菌消毒原则 既要彻底消灭外植体表面的微生物 又要保持外植体正常活力 消毒剂 良好的消毒作用 又要易被无菌水冲掉或自行分解掉 消毒程序 消毒剂种类 浓度和消毒时间 目前常用消毒方法 首先70 75 酒精 30秒 表面杀菌 后用其他消毒剂消毒 如 0 1 升汞 5 10分钟 2 5 次氯酸钠 5 30分钟 茎尖 茎段 叶片消毒程序 70 乙醇30秒 无菌水2 3次 2 5 次氯酸钠10 15分 无菌水3 5次 种子的消毒程序 10 次氯酸钠20 30分 无菌水3 5次 根的消毒程序 自来水冲洗 纯乙醇漂洗 0 1 升汞5 10分 无菌水3 5次 3 诱导培养 1 外植体的切割 叶片0 5 0 8cm2 茎段和顶芽以 cm长为宜 2 接种 形态学下端插入培养基 如茎切段 叶平铺 不可将切块深埋于培养基中 以防无氧呼吸 3 最佳培养基的筛选 主要因素 基本培养基 植物生长物质的种类 浓度和配比 二 培养基及其组成1 培养基的种类 1 基本培养基 包括大量元素和微量元素 维生素和氨基酸 还有碳源和水 常见的有MS White Nitsch B5和N6等 完全培养基 根据各种不同试验要求 在基本培养基中附加一些物质 如各种植物生长物质以及其它有机附加物 如椰乳 香蕉汁 番茄汁 酵母提取物 麦芽等 2 根据培养基的物理状态分 液体培养基和固体培养基 3 根据培养基的无机盐分 高盐 MS 中盐 Miller 低盐 White 培养基 4 根据培养物分 愈伤组织培养基 芽增殖培养基 生根培养基 细胞培养基和原生质体培养基等 2 培养基的组分 1 无机营养成分 植物生长发育必需的元素为14种 大量元素N P K Ca S Mg 大于30mg L 微量元素Fe Mn B Zn Cu Mo Cl Ni 小于30mg L 2 有机营养成分 A碳源 为生长发育提供碳骨架和能源 维持培养基的渗透平衡 主要为糖类 常用蔗糖 一般用量为2 5 B有机N源 构成蛋白质和核酸等生物大分子的组成分 并提供激素 如蛋白质水解产物 氨基酸和有机复合物 3 植物生长物质 A生长素 主要用于诱导细胞的分裂 愈伤组织的形成 和根的分化 如IAA NAA IBA 2 4 D B细胞分裂素 主要用于促进细胞分裂和由愈伤或器官上分化不定芽 也用于茎芽增殖 常用6 BA KT ZT 4 琼脂与pH值 琼脂是由海藻得来的多糖类物质 一般用0 7 1 0 pH一般为5 7间 常用5 8 pH 6 0 培养基变硬 pH 5 0 琼脂不凝固 5 维生素 植物细胞通常是维生素自养型 但合成量太少 需要额外加入少量的维生素 3 培养基的制备 1 母液的配制和保存 培养基母液是指按培养基配方配制浓度高10 100倍的高浓度溶液 2 配制培养基 100ml大量元素 10ml微量元素 10ml铁盐 10ml有机物 生长物质 30g蔗糖 7g琼脂 定容1L 煮沸溶解后灭菌备用 灭菌后的培养基一般隔天再用 因pH变动 偏酸0 1 0 3pH 培养基在低温暗中可保存一段时间 1个月 三 培养方法按培养对象分 原生质体培养和单倍体细胞培养 按培养基类型分 固体培养和液体培养 按培养方式分 悬浮细胞培养和固定化细胞培养 切取 接种 愈伤组织的形成 分化形成小芽或根 试管苗的形成 移栽 植物组织固体培养举例 离体植物细胞 外植体 胚状体 根芽 脱分化 再分化 1 过程 植物体 优势 繁殖速度快不受季节限制工厂化生产幼苗无毒保持优良性状 1 植物细胞培养所需要的营养物质有哪些 2 植物细胞培养的基本技术有哪些 2 组织培养应用 1 植物快速繁殖 植物克隆 珍稀 濒危物种 2 无性繁殖植物脱毒幼苗的培养 紫草 紫草素 愈伤组织 3 提取原料 药物 食品添加剂 香料 色素 杀虫剂 悬浮培养举例在愈伤组织液体培养的基础上发展起来 是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术 1 悬浮培养的特点 1 细胞可以不断增殖 形成高密度的细胞群体 并且适于大规模培养 2 可大量提供较均匀的细胞 为深入细致地研究细胞的生长 分化创造了一个很好的实验方法和条件 2 悬浮培养液的制备 3 悬浮培养类型 1 成批培养 Batchculture 是把细胞接种到一个与外界隔绝的只允许气体和挥发性的代谢物质交换的 营养液体积保持不变的密闭系统中培养 成批培养细胞生长的周期呈 型曲线 细胞培养周期时间长短因植物种类和起始培养细胞的密度而异 滞后期的长短主要取决于在继代时原种培养细胞所处的生长期和转入细胞的数量 当悬浮液达到最大干重产量后 须继代 气升式反应器和机械搅拌式生物反应器 2 连续培养 Continuousculture 是用一定容积的但非密闭的反应器来进行的 培养过程中不断注入新鲜培养基 使其营养物质连续得到补充 细胞的生长和增殖连续进行 恒化培养 恒浊培养 二阶段连续培养法 3 固定化培养 第五节影响植物次级代谢产物累计的因素影响因素 生物条件 外植体 季节 休眠 分化等 物理条件 温度 光 通气 pH 渗透压 化学条件 无机盐 碳源 维生素 氨基酸等 工业培养条件 培养罐 搅拌等 一 外植体选择不同外植体的悬浮细胞培养物 最大次级代谢产物的累计时间各异 二 培养条件的影响培养环境的内在因素 接种和诱导 基本培养基组成 碳源 植物生长调节剂 两步培养法 生长培养基和生产培养基培养环境的外部因素 温度 搅拌频率 培养容器体积 光照 第六节植物细胞培养的生物反应器 摇瓶搅拌型生物反应器环流生物反应器鼓泡塔生物反应器 第七节进展与展望自学 请同学们讨论如何实现 杂种细胞 愈伤组织 杂种植株 植物细胞A 植物细胞B 原生质体A 原生质体B 正在融合的原生质体 去细胞壁 纤维素酶 果胶酶 促融方法 碰到难题 物理 离心