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简答题：1. 基因工程的基本过程：获取目的基因重组体的制备重组体的转换重组体筛选和鉴定外源基因在宿主细胞中的表达2. 基因工程的基本原理：提高外源基因的剂量分子遗传学原理筛选修饰重组基因表达的转录调控元件，如启动子、增强子等分子生物学原理修饰构建蛋白质生物合成的翻译调控元件-分子生物学原理基因工程菌（微型生物反应器）的增殖及稳定生产-生化工程学原理。3. DNA重组载体的功能：为外源基因提供进入受体细胞的转移能力为外源基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力4. DNA重组载体所具备的的条件：具有对受体细胞的可转移性或亲和性，以提高载体导入受体细胞的效率具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点，使得外源基因在受体细胞中稳定遗传具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点，有利于外源基因的剪接插入。5. 质粒的分类、用途及区别：克隆质粒：常用于克隆和扩增外源基因测序质粒：通常高拷贝复制，含有多酶切口的街头片段，便于各种DNA片段的克隆与扩增整合质粒：含有整合酶编码基因及整合特异性的位点序列，克隆在这种质粒上的外源基因进入细胞后，能准确地重组整合在受体细胞染色体DNA的特定位点上。穿梭质粒：含有两个亲缘关系不用的复制子结构以及相应的选择性标记基因，能在两种不同种属的受体细胞中复制检测探针质粒：被设计用来筛选克隆基因的表达调控条件表达质粒：使克隆在合适位点上的任何外援基因均能在受体细胞中高效表达6. 噬菌体和Cos质粒区别：黏粒重组分子进入受体细胞后，依靠质粒DNA部分的复制子结构进行自主复制，其拷贝数取决于质粒本身的性质，而且由于重组分子失去了体内包装的能力，故其分离纯化只能采用质粒的方法。7. T4-DNA连接酶的生物活性：修复双链DNA上的单链缺口连接RNA-DNA杂交双链上的DNA链缺口或RNA链缺口连接完全断开的两个平头双链DNA分子。8. T4-DNA的修饰性活性：5 3的DNA聚合活性3 5的核酸外切酶活性无5 3的核酸外切酶活性。类酶类酶（最常用于DNA重组）类酶酶分子三亚基双功能酶内切酶和甲基化酶不在一起三亚基双功能酶识别位点二分非对称序列4-6bp短序列，大多数为回文结构5-7bp非对称序列切割位点距离识别位点至少1000bp，无特异性在识别位点中或靠近识别位点在识别位点下游24-26bp处限制反应与甲基化反应互斥分开的反应同时竞争限制作用是否需要ATP需要不需要需要9. Klenow酶的生物活性：5 3的DNA聚合活性，使DNA链在模板的指导下延伸3 5的核酸外切酶活性，其主要功能是识别并切除错配的碱基，保证DNA复制的准确性无5 3的核酸外切酶活性无核酸内切酶活性10. Klenow酶的副反应即催化活性：修复由限制性核酸内切酶造成的3凹端，使之成为平头末端以含有同位素的脱氧核苷酸为底物，对DNA片段进行标记用于催化cDNA第二链的合成用于双脱氧末端终止法测定DNA的序列11. 受体细胞的类型及其特点：限制缺陷型：打破细菌转化的种属特异性，提高任何来源的DNA分子的转化效率。重组缺陷型：具有依赖于ATP的双链DNA外切酶和单链DNA内切酶双重活性，用于以外源基因克隆、扩增以及表达为目的的基因工程实验。转化亲和型：利用遗传诱变技术改变受体细胞壁的通透性，提高转化效率遗传互补型：具有与外源基因表达产物活性互补的遗传特征感染寄生缺陷型：对其他生物具有感染和寄生效应，将重组DNA分子导入后，极有可能随着受体菌的感染寄生作用，进入生物体，并广泛传播。12. 以植物为例，常用的转基因方法（14种）细胞融合微细胞介导的基因转移染色体介导的基因转移脂质体介导的基因转移磷酸钙沉淀介导基因转移原生质体融合术显微注射法电脉冲介导的基因转移重组DNA病毒感染重组RNA病毒感染直接转化法接合转移法超声波法基因枪法每种方法要懂得基因转移大概的原理，不能单纯只知道名字。13. 大肠杆菌作为转基因受体的特点：优点：全基因组测序，共有4405个可读框基因克隆表达系统成熟完善繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物。缺点：缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内毒素14. 作为一个真核生物表达系统，酵母的优势：全基因测序，基因表达调控机制比较清楚，遗传操作简单；具有原核细菌无法比拟的真核生物蛋白翻译后修饰加工系统；不含有特异性的病毒，不产生毒素；大规模发酵工艺简单，成本低廉；能将外源基因表达产物分泌至培养基中；酵母是最简单的真核生物（划线部分为：酵母与大肠杆菌之间的比较）15. 异源蛋白形成包含体的主要原因：表达速度过快造成细菌细胞内瞬时间蛋白浓度过高肽段或氨基酸之间在分子力的作用下不能构成正确的结构，培养温度不合适，异源蛋白中个别氨基酸序列不能在寄主细胞中正确表达不能构成正确的结构，寄主本身某些蛋白缺失，e.g.热休克蛋白。膜蛋白。16. 包含体的优、缺点：优点：能简化外援基因表达产物的分离操作能在一定程度上保持表达产物的结构稳定缺点：丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作。体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过30%。17. 信号肽的识别蛋白（大肠杆菌，真菌信号台如何与表达载体结合运输表达）;信号肽合成出来，马上就被核糖体蛋白上的信号肽识别颗粒(SRP)特异性的结合，这一结合可以被SRP的受体捕获，并将正在进行翻译的核糖体固定在膜内侧。SRP是一个由蛋白与RNA组成的复合物。18. 包含体复性操作的方法包括：一步稀释法，蛋白复性与浓度无关，但集聚与浓度关系很大分段稀释法，逐步降低变性剂的浓度，防止二次集聚的发生试剂添加法，精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、PEG、Ca2+蛋白修饰法，氨基柠檬酸酐酰化，蛋白带负电，抑制集聚产物隔离法，将变性的蛋白分子固定化，避免其相互碰撞分子伴侣法，GroELL、GroES、DnaK，固定化，共表达19. 二硫键错配造成的危害：二硫键错配会使得多肽链中的巯基严重的集聚。20. 二硫键如何恢复：化学氧化法：需要电子受体，最廉价的电子受体为空气，二硫键形成是随机的，仅适用于那些不含游离半胱氨酸残基的蛋白质的重折叠二硫键交换法需要还原型和氧化型谷胱甘肽，二硫键形成相对特异，因此适用性较广，重折叠效果好。21. 泛素依赖型蛋白降解：在泛素依赖型的蛋白质降解途径中，这个蛋白因子的C端Leu-Arg-Gly-Gly序列首次与各种靶蛋白的游离氨基基团形成共价结合物，这些结合物在泛素激活酶E1、泛素运载酶E2以及泛素连接酶E3的作用下依照一定路线降解为短小肽段直至氨基酸。（P160）22. 泛素在蛋白质降解中的作用：以分泌的形式表达重组异源蛋白，异源蛋白在与泛素形成共价结合物之前，迅速被转位到分泌器中，即可有效避免降解作用；将外源基因的表达置于一个可诱导的启动子控制之下，由于异源蛋白质在短期内集中表达，分子数占绝对优势的表达产物便能逃脱泛素的束缚，从而减少由降解效应带来的损失；使用泛素生物合成缺陷的突变株作为外源基因表达的受体细胞。23. 线状质粒结构特点：（主要是两端）缺少经典的启动子结构，因此质粒上的基因转录需要自身编码的RNA聚合酶，可读框上游都没有酵母核RNA聚合酶的识别位点，但在转录起始位点上游14bp处含有一个ACT(A/T)AATATATGA的保守序列（UCS），这是质粒编码的RNA聚合酶的专一性识别结合位点，但这种质粒来源的RNA聚合酶基因的表达仍需使用宿主细胞的转录系统。24. 用于酵母的显性筛选标记 常见于哪个宿主？ 蛋白质基因类型说明氨基糖苷磷酸转移酶Aph（Tn601）抗氨基糖苷G418氯霉素乙酰转移酶CAT（Tn9）抗氯霉素在不可发酵的碳源上生长，ADC1启动子二氢叶酸还原酶Dhfr减少氨甲蝶呤和磺胺的抑制异-1-细胞色素c启动子未定性Ble抗草霉素异-1-细胞色素c启动子、LEU2启动子铜离子螯合物CUP1抗铜离子自身启动子转化酶SUC2蔗糖的作用AOX1启动子、XPR2启动子乙酰乳酸合成酶ILV2r抗硫酰脲除草剂自身启动子EPSP合成酶AroP抗草甘膦ADH1启动子、CYC1终止子25. 蛋白质分泌过程：新合成的分泌型蛋白质在翻译过程中进入内质网膜腔新生肽链的N端与信号肽识别颗粒（SRP）形成复合物，抑制肽链的延长SRP复合物与内质网膜外表面的SRP受体特异性结合新合成的多肽链在N端信号肽的作用下穿过内质网膜，进入内腔，同时被信号肽酶专一性切除信号肽新生肽链的合成重新进行。在内质网内腔中的寡聚多糖核装配进入高尔基体的分泌性蛋白在其寡聚多糖核上进行外链的延伸反应，最终形成全糖基化的分泌型蛋白质。分泌蛋白在胞芽集中，通过膜融合作用转入至分泌型泡囊中泡囊将蛋白质运输至细胞膜内侧，在GTP结合蛋白复合物的作用下，与细胞膜发生融合，将蛋白质释放到细胞周质中。26. 将外源基因导入动物细胞的方法：装基因的动物受体细胞系统、动物细胞物理转化法（磷酸钙共沉淀法、电击法、脂质体包埋法、DNA显微注射法）、动物病毒转染法、工程胚胎干细胞法、体细胞转基因克隆法。27. 腺病毒结构（重点）：为线型双链DNA病毒，无包膜，呈二十面体，共有93个成员，分两个属：哺乳动物腺病毒属和禽腺病毒属。目前已鉴定的人腺病毒有6个亚属，其中常用来构建载体的腺病毒主要为C亚属的2型（Ad2）和5型病毒（Ad5）。腺病毒感染人体细胞时呈裂解型，不会致癌；对啮齿目动物细胞来说，绝大多数的腺病毒成员均能致癌。28. 腺病毒作为转化载体的特点（重点）：基因组重排率低，安全性能好，宿主范围广，重组病毒的效价高，外源基因在载体上容易高效表达。缺陷：重组的外源基因不能持久表达，而且病毒蛋白对体液和T淋巴细胞具有免疫原性。29. 猴肿瘤病毒SV40与腺病毒的差异（重点）：SV40为双链环状DNA病毒，它衍生出的载体在使用时受到许多限制：只能转染猴细胞，外源基因的装载量较小，而且基因组常常发生重排和缺失的现象。30. 反转录病毒特点：是一种整合型的单链RNA病毒，一般携带两个拷贝的单链RNA基因组，其上包括6个区域，从5端依此为：5长末端重复序列（5-LTR，含转录起始信号）；+区，非编码区，病毒颗粒包装的信号序列；gag基因，病毒内壳蛋白编码序列；pol基因，反转录酶及整合酶结构基因；env基因，病毒颗粒外层包装蛋白编码序列；3长末端重复序列（3-LTR，含poly（A）化信号序列）。31. 利用反义基因抑制细胞基因表达（原理）：从细胞中分离靶基因的mRNA并以此为模板，由细菌RNA聚合酶体外合成其互补RNA链，然后将之注射到细胞中。根据靶基因序列，设计并体外合成一小段单链DNA，它与靶基因mRNA5端的翻译起始区互补并抑制其翻译。将靶基因的部分序列反向克隆在一个强启动子的下游，构成反义子结构，并以此作为转基因，转化动物受体细胞。反义子利用其转录产物的互补作用特异性阻断靶基因mRNA的翻译，产生靶基因缺陷型和相关功能丧失型的转基因动物模型。32. RNA干扰：指内源性或外源性双链RNA（dsRNA）介导的细胞内mRNA发生特异性降解，从而导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型的缺失现象。33. 干扰RNA阻断特定基因表达的特点：为实现对特定靶基因表达的阻断，体外构建能够表达特定siRNA的重组分子，导入细胞内使其转录出相应的siRNA，然后由细胞内的上述固有编辑途径实现对基因表达的干扰作用。34. 动物细胞高效表达异源蛋白的基本方法（？）：增加异源基因在寄主细胞内的含量，利用高表达载体DHFR-MTX高效表达系统和GS-MSX高效表达系统，降低寄主对异源蛋白的降解速度。35. GS-MSX高效表达系统原理：谷氨酰胺合成酶（GS）能解除甲硫氨酸亚砜（MSX）对动物细胞的毒害作用。 先将带有GS编码基因的载体转入培养的哺乳动物细胞中，由于只有多拷贝的GS编码基因才能抗MSX，所以在转染过程中不必使用GS缺陷型的受体细胞。 在正常的MSX浓度下就能筛选到含有高拷贝外源基因的转染细胞，这是GS-MSX系统比DHFR-MTX系统优越之处。 36. DHFR-MTX高效表达系统氨甲喋呤（MTX）是动物细胞中的关键代谢酶二氢叶酸还原酶（DHFR）的特异性抑制剂，细胞培养物经氨甲喋呤处理后，绝大多数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性细胞中，dhfr基因均得以扩增。 这些抗性细胞正是通过增加相关基因的拷贝数、提高关键代谢酶的表达水平，从而抵消氨甲喋呤的抑制效应。更重要的是，扩增的区哺乳动物细胞内的基因扩增现象域远远大于dhfr基因本身，即与dhfr基因相邻的DNA区域同时被扩增37. Ti质粒：P225-228 229图(重点)38. Ti质粒介导的二元整合转化系统特点：含有vir区段的T-DNA含有带有外源基因的，可以同时在农杆菌和大肠杆菌中增殖的T-DNA两质粒含有同源区段上述两个质粒在根瘤农杆菌中发生重组，最终外源基因转入植物细胞中。39. Ti质粒介导的整合转化程序的特点：该程序构建的转基因植株再生效率高，外源基因在转入并整合到植物基因组中后，通常不发生重大的修饰改变，使用这种方法所转入的外源基因一般拷贝数较低，大多为单拷贝转移。40. 途径工程研究的重点是（1）增加代谢途径中限速步骤酶编码基因的拷贝数。（2）强化以启动子为主的关键基因的表达系统。 （3）提高目标途径激活因子的合成速率。 （4）灭活目标途径抑制因子的编码基因。 （5）阻断与目标途径相竞争的代谢途径。41. 应用转基因技术安全性问题：基因工程安全隐患1. 对环境的影响：重新组合一种在自然见尚未发现的的生物性状有可能给现有的生态环境带来不良影响。2. 新型病毒的出现：制造带有抗生素抗性基因或有产生病毒能力的基因的新型微生物有可能在人类或其它生物体内传播。3. 癌症扩散：将肿瘤病毒或其它动物病毒的DNA引入细菌有可能扩大癌症的发生范围。4.人造生物扩散：新组成的重组DNA生物体的意外扩散可能会出现不同程度的潜在危险。42. 你认为的基因工程技术的应用领域有哪些（发挥题）（看看应用）基因工程技术已广泛应用于医、农、牧、渔等产业，甚至与环境保护也有密切的关系。研究成果最显著的是基因工程药物，转基因植物的研究也取得了喜人的成果。1、在医药业的应用（1）转基因细菌生产激素类药物（2）转基因细菌生产抗生素：（3）转基因微生物生产疫苗：2. 在工业原料生产上的应用（1）转基因微生物生产高分子多聚物（2）转基因微生物与环境净化和废料再生名解：1. 基因工程：以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物现代方法为手段将一段目的DNA引入寄主，从而在基因水平改造一个生物的技术学科。2. Cos质粒：在噬菌体线性双链DNA分子的两端，各有一个12碱基组成的互补单链，成为Cos末端。Cos质粒是人工构建的含有DNA的Cos位点和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。3. 限制性核酸内切酶：存在于任何一种原核细菌中，它能在特异位点上催化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性片段。4. 酶单位的定义：一个国际通用酶单位指在25、最适条件下，1min内能引起1mol底物发生反应的酶量。以U表示。5. 启动子（Promoters）：DNA分子上结合RNA聚合酶并形成转录起始复合物的区域。6. 终止子（terminator）：促进转录终止的DNA序列，在RNA水平上通过转录出的终止子序列形成柄-loop结构而起作用。又可分为依赖于的终止子和不依赖于的终止子两类。7. 多克隆位点（MCS multi-clone site）：DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点，能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。8. 密码子（code）：信使RNA链上决定一个氨基酸的相邻的三个碱基称为一个密码子，又称三联体密码。9. SD序列：位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5UAAGGAGG 3,即SD序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16SrRNA3端区域3AUUCCUCC5与之专业结合，将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译。10. 包含体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构。11. 信号肽：在原核细菌中分泌型蛋白的N端存在15-30个左右的氨基酸序列，位于前段的多为机型氨基酸，中后部皆为连续排列的疏水氨基酸，对蛋白质的运输起决定作用。12. 信号肽的识别蛋白（大肠杆菌，真菌信号台如何与表达载体结合运输表达）;信号肽合成出来，马上就被核糖体蛋白上的信号肽识别颗粒(SRP)特异性的结合，这一结合可以被SRP的受体捕获，并将正在进行翻译的核糖体固定在膜内侧。SRP是一个由蛋白与RNA组成的复合物。13. 泛素：是一种高度保守并分布广泛的真核生物多肽，由76个氨基酸残基组成。14. ARS：酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每30-40kb就有一个ARS元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、标记基因。15. CEN: 酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列16. TEL：线性染色体两端的特殊序列，这种序列广泛分布在原生动物、真菌、植物和哺乳动物的染色体中，并且在序列组成上十分相似，富含G，且由短的基本序列随机串联重复而成。17. 转基因：是指在DNA操作过程中整合到动植物受体细胞染色体上的外源基因。18. 转基因生物制品（GMO/TO）：含有转基因并为其遗传修饰了的动植物发育个体。19. RNA干扰：指内源性或外源性双链RNA（dsRNA）介导的细胞内mRNA发生特异性降解，从而导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型的缺失现象。20. 第三代基因工程：为途径工程，是一门利用分子生物学原理系统分析细胞代谢网络和信号转导网络，并通过DNA重组技术合理设计和遗传修饰之，进而完成细胞特性改造的应用性学科。21. 基因组工程：（第四代基因工程）是指整个基因组或染色体的转移。填空or选择1. 第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表达经典基因工程。第二代基因工程蛋白编码基因的定向诱变蛋白质工程。第三代基因工程代谢信息途径的修饰重构途径工程。第四代基因工程基因组或染色体的转移基因组工程2. 基因工程诞生：1973年，美，斯坦福大学，Cohen和Boyer等建出含四环素和链霉素两个抗性基因的重组质粒分子，导入大肠杆菌，表达，赋予抗性。3. 基因工程成熟：1978年，美Genentech公司开发出利用重组大肠杆菌合成胰岛素的先进生产工艺，揭开基因工程产业化的序幕。4. 基因工程的基本过程：获取目的基因重组体的制备重组体的转换重组体筛选和鉴定外源基因在宿主细胞中的表达。5. 质粒基本特性：1自助复制性2可扩增性3可转移性4不相容性（具有相同或相似复制子结构及调控模式的两种不同的质粒不能稳定存在于同一受体细胞内的特性。）6. 噬菌体是双链线性DNA分子；M13噬菌体是单链噬菌体DNA载体；黏粒载体（cosmid）是一种噬菌体-质粒杂合载体。（选择）7. 基因工程操作中，最常用的限制性核酸内切酶酶是类限制性核酸内切酶。8. T4-DNA连接酶的来源：T4-DNA连接酶有T4噬菌体基因编码，商品化的T4-DNA连接酶均由大肠杆菌基因工程菌生产。9. Klenow酶的来源：实际上是大肠杆菌的=DNA聚合酶C端的大片段，由Klenow通过枯草杆菌蛋白酶位点特异性降解的方法从DNA聚合酶中制备。10. 起始密码子是AUG；终止密码子：UAA，UAG，UGA11. 确定启动子三种方法：鸟枪法克隆：pK01酶保护法分离：质粒，RNA聚合酶，限制性内切酶滤膜结合法分离：硝酸纤维素膜。12. 常用于基因工程寄主的酵母菌突变株有：提高重组异源蛋白产率的突变宿主；抑制超糖基化作用的突变宿主；减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主；内源性蛋白酶缺陷型的突变宿主。13. 酵母载体系统的结构：由野生型质粒和宿主染色体DNA上的自主复制子结构（ARS）、中心粒序列（CEN）、端粒序列（TEL）以及用于转化子筛选鉴定的功能基因构建而成。14. 端粒的作用：线性染色体避免因为复制造成两端缺失。造成致死突变。15. 酵母启动子的可调控表达系统：温度控制表达系统、超诱导表达系统、严紧控制表达系统。（搞清P171-173）16. 酵母菌的蛋白修饰分泌系