动物垫料中绿脓杆菌检测方法

ICS07.100.99B 41DB15内蒙古自治区地方标准DB 15/T XXXXXXXXX动物垫料中绿脓杆菌检测方法Method for Detection Pseudomonps aeruginosa in animal bedding点击此处添加与国际标准一致性程度的标识XXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施内蒙古自治区市场监督管理局发布DB15/T XXXXXXXXX前言本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国呼和浩特海关、二连浩特海关、二连浩特市疾病预防控制中心。本标准主要起草人：赵治国、敖威华、杨帆、延涵、王海艳、陈林军、崔强、韩祎陟、郭文丽、马彩霞。I动物垫料中绿脓杆菌检测方法1 范围本标准规定了动物垫料中绿脓杆菌的定性检测方法。 本标准适用于动物垫料中绿脓杆菌定性检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB 19489 实验室生物安全通用要求GB/T 33682 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则SN/T 1538.1 培养基制备指南 第1部分：实验室培养基制备质量保证通则SN/T 1538.2 培养基制备指南 第2部分：培养基性能测试实用指南3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1动物垫料 animal bedding用于吸收动物排泄物，使动物保持舒适生活环境的铺垫物。包括动物笼内非直接与动物机体接触的铺垫物。4 设备和材料4.1 冰箱：2 5 。4.2 全自动细菌鉴定系统或飞行时间质谱仪。4.3 二级生物安全柜。4.4 天平：感量 0.1 g。4.5 无菌吸管：1 mL(具0.01 mL刻度)、10 mL(具0.1 mL刻度)或微量移液器及吸头。4.6 高压灭菌器。4.7 无菌量筒：250 mL。4.8 无菌试管：18 mm180 mm。4.9 均质器及灭菌带滤膜的均质袋。4.10 恒温培养箱：36 1 。4.11 无菌接种针、接种环4.12 显微镜。4.13 无菌培养皿：15 mm90 mm。4.14 无菌试管：18 mm180 mm。4.15 无菌棉签。4.16 无菌镊子。4.17 无菌剪刀。4.18 无菌勺。4.19 无菌玻片5 培养基和试剂5.1 实验用水：符合GB/T 6682的要求。5.2 SCDLP增菌液：见附录 A.2。5.3 假单胞菌CFC选择性培养基：见附录A.3。5.4 假单胞菌CN选择性培养基：见附录A.4。5.5 氧化酶试验：见附录 A.5。5.6 革兰氏染液：见附录 A.6。5.7 绿脓菌素培养液：详见详见附录 A.7。5.8 硝酸盐蛋白胨水培养基：见附录 A.8。5.9 明胶液化培养基：见附录 A.9。5.10 营养琼脂：见附录 A.10。5.11 生化鉴定试剂盒。5.12 革兰氏阴性菌生化鉴定卡。5.13 飞行质谱仪靶板。5.14 绿脓杆菌标准菌株 ATCC 27853或等效菌株。6 检验程序 绿脓杆菌检验程序见图1。样品制备检样25g或25cm2样液+225mL SCDLP增菌液 36 1 ，24 h 2 h CFC和CN平板挑取可疑菌落，接种营养琼脂平板 36 1 ，24 h 2 h36 1 ，18 h24 h革兰氏染色 全自动细菌鉴定系统或飞行时间质谱仪鉴定42生长明胶液化硝酸盐还原产气氧化酶试验绿脓菌素试验报 告图1 绿脓杆菌检验程序7 操作步骤7.1 采样和增菌7.1.1 采样原则 样品采集应遵循随机性、代表性的原则。采样过程遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染。7.1.2 颗粒状或粉末垫料样品对送检样品包装内不同部位样品进行随机多点取样至少250 g，充分混匀后无菌称取25 g颗粒状或粉末状垫料样品，加入225 mL SCDLP，充分振摇或均质1 min2 min，置36 1 培养24 h2h。7.1.3 平面垫料样品无菌操作将灭菌规格板（5 cm5 cm）放在平面垫料表面，用浸有无菌稀释液（磷酸缓冲液或生理盐水）的棉拭子，在规格板内来回均匀涂抹整个方格 3 次，并随之转动棉拭子，然后用灭菌剪刀剪去棉拭子与手接触的部分，将棉拭子头置入装有 25 mL无菌稀释液的无菌锥形瓶中，根据样品面积大小重复取样14个规格板面积，相应地将棉拭子头置入25 mL100 mL的无菌稀释液中，充分振摇制成样品原液（1 mL原液对应的样品面积为1 cm2）。取25 mL样品原液加入225 mL SCDLP，充分振摇或均质1 min2 min，置36 1 培养24 h2 h。表1 不同面积平面类垫料样品采样量样品面积m2采样量cm2规格板数小于0.25（含）2510.250.5（含）5020.50.75（含）753大于0.7510047.2 分离培养SCDLP增菌液用灭菌接种环各取1环，分别划线接种于CFC平板和CN平板，于36 1 分别培养24 h2 h，观察菌落形态。绿脓杆菌在这两种平板上通常呈现圆形、平滑、湿润的黄绿色菌落，在紫外光照射下可观察到荧光。少数不形成黄绿色菌落，但有特殊芳香气味。从每个平板上挑取510个（若少于5个则全部挑取）可疑菌落，分别接种到营养琼脂平板培养基上，36 1 培养18 h24 h，取纯培养物进行鉴定。7.3 鉴定7.3.1 革兰氏染色 挑取营养琼脂平板培养基上的纯培养物，进行革兰氏染色，绿脓杆菌为革兰氏阴性杆菌。7.3.2 生化鉴定7.3.2.1 氧化酶试验挑取营养琼脂平板培养基上的纯培养物，进行氧化酶试验，绿脓杆菌氧化酶试验呈阳性。7.3.2.2 绿脓菌素试验挑取营养琼脂平板培养基上的纯培养物,接种在绿脓菌素测定培养基上,置 361 培养 24 h2 h ,加入三氯甲烷3 mL5 mL ,充分振荡使培养物中的绿脓菌素溶解于三氯甲烷液内,待三氯甲烷提取液呈蓝色时,用吸管将三氯甲烷移到另一试管中并加入1 mol/L的盐酸1 mL左右,振荡后,静置片刻。如上层盐酸液内出现粉红色到紫红色时为阳性,表示被检样品中有绿脓菌素存在。若阴性，则进行以下生化鉴定。7.3.2.3 硝酸盐还原产气实验挑取营养琼脂平板培养基上的纯培养物，接种到硝酸盐蛋白胨水培养基中，置36 1 分别培养24 h2 h，小导管中有气体产生，即为阳性。表明该菌能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氮气。7.3.2.4 明胶液化试验挑取营养琼脂平板培养基上的纯培养物，划线接种到明胶培养基中，置36 1 分别培养24 h2 h，取出放2 8 冰箱10 min30 min，仍呈溶液状为明胶液化试验阳性，凝固不容为阴性。7.3.2.5 42 生长试验挑取营养琼脂平板培养基上的纯培养物，接种到普通营养琼脂斜面培养基上，置42 1 分别培养24 h48 h，能生长为阳性。7.3.2.6 绿脓杆菌生化特性表2 绿脓杆菌生化特征生化试验绿脓杆菌氧化酶+绿脓菌素试验硝酸盐还原产气+明胶液化+42生长+注：“+”表示阳性；“-”表示阴性。也可用生化鉴定试剂盒进行绿脓杆菌生化鉴定，具体操作依据绿脓杆菌生化鉴定试剂盒说明书。7.3.3 辅助设备鉴定 可根据实验室情况，选用全自动细菌鉴定系统或飞行时间质谱仪等对典型或可疑菌落进行鉴定，具体操作依据相关标准或仪器设备说明书。8 结果与报告8.1 绿脓杆菌生化试验，全自动细菌鉴定系统或飞行时间质谱仪鉴定为阳性的菌株，报告动物垫料样品中检出绿脓杆菌。8.2 绿脓杆菌生化试验，全自动细菌鉴定系统或飞行时间质谱仪鉴定为阴性的菌株，则报告动物垫料样品中未检出绿脓杆菌。9 生物安全措施为了保护实验室人员安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置，应按照GB 19489 的有关规定执行。10 废弃物处理和防治污染的措施检测过程中的废弃物需经121 高压灭菌处理至少30 min后再弃置。AA附录A （规范性附录）培养基和试剂A.1 培养基制备及质量保证按照SN/T 1538.1和SN/T 1538.2执行，并对制备好的培养基进行性能测试，如使用等效的脱水合成培养基，使用前对其进行验收并按其说明书使用。A.2 SCDLP增菌液A.2.1 成分酪蛋白胨 17.0 g大豆蛋白胨 3.0 g氯化钠 5.0 g磷酸氢二钾 2.5 g葡萄糖 2.5 g卵磷脂 1.0 g吐温-80 7.0 g蒸馏水 1000 mLA.2.2 制法将上述各成分加热煮沸至完全溶解，调节pH至7.27.3，分装适宜容器，121 高压灭菌20 min。A.3 假单胞菌CFC选择性培养基A.3.1 基础培养基A.3.1.1 成分蛋白质 20.0 g硫酸钾 10.0 g氯化镁 1.4 g十六烷三甲基溴化胺 0.3 g琼脂 13.6 g丙三醇 10 mL蒸馏水 1000 mLA.3.1.2 制法除琼脂外，将其余成分溶解于蒸馏水中，调节pH至7.20.2加热溶解，分装适宜容器，121高压灭菌15 min，备用。A.3.2 CFC添加剂A.3.2.1 成分十六烷三甲基溴化胺 5.0 mg头孢菌素 25.0 mg夫西地酸 50 mgA.3.2.2 制法取无菌水和无水乙醇各1 mL混合均匀，将上述成分溶解于混合液中，摇匀，备用。A.3.3 使用方法待基础培养基冷却至50 左右，每500 mL基础培养基加入2 mL添加剂，倾注无菌平板。A.4 假单胞菌CN选择性培养基A.4.1 基础培养基A.4.1.1 成分 蛋白胨 16.0 g水解酪蛋白 10.0 g硫酸钾 10.0 g氯化镁 1.4 g琼脂 15.0 g蒸馏水 1000 mLA.4.1.2 制法除琼脂外，将其余成分溶解于蒸馏水中，调节pH至7.20.2，加入琼脂，加热溶解，分装适宜容器121高压灭菌15 min，备用。A.4.2 CN添加剂A.4.2.1 成分十六烷三甲基溴化胺 100.0 mgA.4.2.2 制法取无菌水和无水乙醇各1 mL混合均匀，将上述成分溶解于混合液中，摇匀，备用。A.4.3 使用方法待基础培养基冷却至50 左右，500 mL基础培养基加入2 mL添加剂，摇匀后倾注平板。A.5 氧化酶试验A.5.1 试剂1 盐酸二甲基对苯二胺溶液:少量新鲜配制，于冰箱内避光保存。1 a-萘酚乙醇溶液。A.5.2 试验方法取白色洁净滤纸沾取菌落，加盐酸二甲基对苯二胺溶液一滴，阳性结果呈现粉红色，并逐渐加深;再加a-萘酚乙醇溶液一滴，阳性结果在0.5 min内呈现鲜蓝色，阴性结果2 min内不变色。(或用毛细管吸取试剂，直接滴加于菌落上，其显色反应与以上相同。)A.6 革兰氏染液A.6.1 染液制备A.6.1.1 结晶紫染色液结晶紫 1 g95 %乙醇 20 mL1 %草酸铵水溶液 80 mL将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。A.6.1.2 革兰氏碘液碘 1 g碘化钾 2 g蒸馏水加至 300 mL将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300 mL。A.6.1.3 脱色液95 %乙醇。A.6.1.4 复染液A.6.1.4.1 沙黄复染液沙黄 0.25 g95 %乙醇 10 mL蒸馏水 90 mL将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。A.6.1.4.2 稀石碳酸复红液称取碱性复红10 g，研细，加95%乙醇100 mL放置过夜，滤纸过滤。取该液10 mL，加5 %石碳酸水溶液90 mL混合，即为石碳酸复红液。再取此液10 mL加水90 mL ，即为稀石碳酸复红液。A.6.2 染色法A.6.2.1 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1 min，水洗。A.6.2.2 滴加革兰氏碘液，作用1 min，水洗。A.6.2.3 滴加95 %乙醇脱色，约30 s或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10 s，水洗。A.6.2.4 滴加复染液，复染1 min ，水洗，待干，镜检。A.7 绿脓菌素测定用培养基A.7.1 成分蛋白胨 20 g氯化镁 1.4 g硫酸钾 10 g琼脂 18 g甘油（化学纯） 10 g蒸馏水 1000 mLA.7.2 制法将蛋白胨、氯化镁和硫酸钾加到蒸馏水中，加温使其溶解，调pH至7.4，加入琼脂和甘油，加热溶解，分装于试管内，115 高压灭菌20 min后，制成斜面备用。A.8 硝酸盐蛋白胨水培养基A.8.1 成分蛋白胨 10 g酵母浸膏 3 g硝酸钾 2 g亚硝酸钠 0.5 g蒸馏水 1000 mLA.8.2 制法将蛋白胨和酵母浸膏加到蒸馏水中，加热使之溶解，调pH为7.2，煮沸过滤后补足液量，加入硝酸钾和亚硝酸钠，溶解混匀，分装到加有小倒管的试管中，115 高压灭菌20 min后备用。A.9 明胶培养基A.9.1 成分牛肉膏 3 g蛋白胨 5 g明胶 120 g蒸馏水 1000 mLA.9.2 制法取各成分加到蒸馏水中浸泡20 min，随