细胞培养实验集合.doc

实验一 培养基的配制及细胞培养的条件一、 培养基的特性细胞生存的环境与条件1、 温度条件（37 0.5）2、 pH条件 （7.2-7.4）3、 气体条件4、 水的质量（三蒸）5、 渗透压6、 营养条件7、 无菌条件二、 培养基的分类1、 平衡盐液 2、 天然培养基（小牛血清、胚胎液）3、 合成培养基（化学成分清楚）三、 RPMI1640培养基的配制1、RPMI1640 10 g2、 电磁搅拌 过滤出菌 无菌实验丙酮酸钠 .0.11 g3、 Hepes（羟乙基哌碃乙硫磺酸） 5.925 g4、 NaHCO3 2 g5、 三蒸水 1000 mL四、 过滤出菌 仪器：不锈钢正压滤器 材料：纤维素微孔虑膜 （0.22 mm 孔径）装好后消毒五、 完全培养基的配制RPMI 1640 培养液 85 mL小牛血清 10 mL谷氨酰氨 1 mL抗菌素（青、链霉素） 1万单位 1 mL实验二 动物细胞培养细胞培养是指从生物体内取出组织或细胞，在体外模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存、生长和繁殖，并维持其结构和功能的方法。由于体外培养的细胞其结构和功能接近体内情况，便于使用各种技术和方法进行研究，并能在较长时间内直接观察细胞生长、发育、分化过程中的形态和功能变化，而且可同时提供大量生物学性状相似的细胞作为研究对象。所以细胞培养已经成为现代医学研究中一项非常重要的技术。细胞培养不但是一门技术，也是一门科学，有它的基本理论、基本知识、和基本方法。一、实验目的 1. 使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的基本操作过程； 2. 学习动物细胞原代培养和传代培养的基本方法，掌握动物细胞培养中的无菌操作技术，以及培养细胞的形态分类特点； 3. 以所培养细胞为材料，了解细胞冻存的几种简易方法并通过实验掌握其中的一种方法； 4. 以所培养细胞为材料，学习动物细胞融合的几种方法并掌握其中的一种方法。 二、实验条件 本实验在细胞工程实验室完成。1、需要提供CO2培养箱，细胞融合仪，冷冻仪，研究用成像显微镜，体视成像显微镜，普通显微镜，生化培养箱，全自动高压灭菌锅，水浴锅，超声波清洗仪，超净工作台，真空泵，冷冻离心机，干燥箱，剪刀，镊子，液氮罐，纯水器，低温冰箱，普通冰箱等。 2、各种规格培养瓶、离心管，吸水纸，各种试剂瓶，培养皿 3、生化试剂：胰蛋白酶，胶元蛋白酶，M9培养基，DMEM，RPMI1640培养基，M199培养基，牛尾胶元，肝素，秋水仙素，PHA，小牛血清，青霉素，链霉素，EDTA，HEPES，Hanks液，Earle液，荧光染料，快绿，谷氨酰胺，聚乙二醇， 4、实验动物：小白鼠，兔子 三、实验要求 1、根据细胞工程理论课所学知识，就以上实验目的设计出实验方案（包括所选用材料、实验技术、方法）； 2、实验方案须交指导教师修改，然后开始实验； 3、实验过程中要严格遵守操作规程，独立完成。 4、设计实验方案前要多查阅文献资料，根据实际情况来选材、设计，尽量做到就地取材。 5、实验完成后，要认真分析实验结果，总结实验成败的因素，写出详细的实验报告。 四、实验说明 1、本实验的实验内容包括以下几点：1. 动物组织细胞形态观察与识别；2. 动物细胞的贴壁培养；3. 动物细胞的悬浮培养；4. 动物组织细胞的原代和传代培养；5. 动物细胞的冷冻保存；6. 动物细胞的融合。 2、要使细胞在体外长期生存，必须模拟体内环境，供给细胞存活所必须的条件，如：水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖、生长因子等，还要受到温度、渗透压等多种因素的影响。细胞培养用品的清洗、培养用液的配制、除菌等均有严格的要求，特别是无菌操作，是细胞培养成败的关键。 3、直接从生物体内获取细胞进行首次培养称为原代培养，当培养的细胞增殖达到一定密度后，需要做再培养，即将培养的细胞分散后，以一定的比率从一个容器转移到另一个容器中扩大培养，为传代培养。传代培养的累积次数就是细胞代数。 4、大多数细胞在体外培养时能贴附在支持物表面生长，称贴附型生长细胞，少数种类的细胞在培养时不贴附在支持物表面，而呈悬浮状态生长，称为悬浮型生长细胞。5、在细胞培养过程中，细胞的传代及日常维持工作需要大量的耗费，而且随着传代次数的增加，体外培养细胞的生物特性会慢慢发生变化，因此需要对培养细胞进行及时的冻存，必要的时候在复苏。6、两个以上细胞合并成一个双核或多核细胞，成为细胞融合。五、注意事项 1、每班成立一个班长负责制的开放实验管理小组，成员为每小组的组长，负责安排相关同学配合教师完成以下工作：（1）实验前领取实验试剂和器具；（2）实验过程中实验室的水电、药品安全、仪器使用和登记情况、清洁卫生；（3实验完成后整理实验室。 2、实验过程中要严格遵守操作规程，独立完成。做到爱护仪器、节约材料和药品。实验完毕应及时清洁整理用过的实验仪器和用品。六、思考题 1、简述体外培养细胞的生存条件。 2、在细胞培养中如何防止污染？ 3、为什么培养细胞长成致密单层后要进行传代培养？ 4、简述贴附型生长细胞和悬浮型生长细胞传代培养的主要方法和步骤。 5、进行细胞融合时要注意哪些问题？细胞融合率受哪些因素的影响？ 6、冷冻过程中为什么要用慢速冷冻的方法？实验三 动物细胞连续传代培养（SP2/0细胞）一、实验目的：1、为细胞融合准备SP2/0小鼠骨髓瘤细胞；2、杂交瘤细胞的扩大培养（种腹水），或传代培养。二、实验原理：小鼠骨髓效力细胞株（NSI，SP2/0）和杂交瘤细胞均具有无限生长繁殖的能力，它们都属于半贴壁细胞，不用胰蛋白酶或EDTA消化液，只需轻轻冲洗瓶壁上的细胞便可脱落。因而可以利用这些特性对这类细胞进行连续传代培养，以为实验提供生长旺盛的细胞（对数生长期的细胞）。三、实验材料：SP2/0细胞（或杂交瘤细胞）CO2培养箱、细胞培养瓶（25、50、100毫升）、弯头滴管、消毒用套筒（玻璃或铜质）、吸头、RPMI-1640完全培养基、倒置显微镜、试管架、酒精灯、灭菌高压锅。四、实验步骤：1、复苏的或转瓶的传代细胞，使细胞浓度大约为5104/毫升，置375%CO2培养箱中培养。2、培养48小时后，可见部分细胞贴壁生长，而部分细胞呈漂浮状态，可用滴管吸去漂浮的细胞，加入少量新鲜培养基继续培养24小时以上。3、若细胞生长过密，则需及时冲下并吸出部分细胞，或将吸出的细胞转瓶扩大培养，如果不是这样处理，细胞很易出现衰老、死亡现象，对于杂交瘤来讲，这样更易诱发阳性克隆丢失可能性。4、用于细胞融合的骨髓细胞，必须在生长繁殖的对数期（约105细胞/毫升），而且细胞形态规则要一致（圆而亮，有一定的立体感），机能要活跃，活细胞数在9095%以上。要得到这种细胞，其培养技巧在于，在融合前24小时，将生长良好的细胞全部自瓶壁冲下来，并除去1/2或更多的细胞，加入新鲜培养液令细胞重新贴壁分裂增繁。5、作为长期在体外传代培养的细胞，为减少工作量，可采用810%小牛血清的培养基，这样细胞的繁殖速度亦慢，一般可间隔3天更换一次培养液。6、本试验要求各组将细胞自小瓶转入中瓶再转入较大的培养瓶中生长，并用对数增长期的细胞用于冻存和复苏实验（见实验六）。五、结果观察：1、细胞传代前后的生长状态及速度的观察；2、细胞转瓶后生长情况观察；3、了解生长良好，一般及较差细胞的显微镜下观察；4、传代细胞培养的体会。六、注意事项：1、连续细胞传代培养更应注意无菌操作；2、传代时机对于细胞生长的状况及速度十分重要，尤其要注意不能等细胞出现老化后再传代，那样做一般结果并不如愿；3、传代转瓶时细胞量的取舍主要根据细胞量的多少，生长条件优劣以及个人实践经验而决定；4、用于冻存、融合、传代的细胞都要求是处于对数增长期的细胞，不能勉强 为之。实验四淋巴细胞杂交瘤的制备一、实验目的1、系统了解淋巴细胞杂交瘤实验技术的全部过程；2、学会观察与判别融合细胞的出现，并计算融合率。二、实验原理：小鼠骨髓瘤可以在体外培养液中生存并大量繁殖。经过用某种抗原免疫的小鼠及淋巴细胞能分泌某种抗体，但小鼠的B淋巴细胞在一般培养某中不易存活。如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌霜种抗体的B淋巴细胞在融合因子（聚乙二醇，PEG）作用下产生融合，则融合的细胞既具有肿瘤细胞易分裂增殖的特性，又具有B淋巴细胞分泌特异性抗体的能力，在HAT选择培养基中可以选择得到杂交细胞。这种融合的被称为淋巴细胞杂交瘤的细胞可以在体外培养液中大量繁殖生长，从培养液上清中可以收集到大量某B淋巴细胞产物单克隆抗体。三、实验材料：免疫的BALB/小鼠，SP2/O骨髓瘤细胞株，CO2培养箱超净工作台倒置显微镜光学显微镜恒温水箱计数板、计数器、盖玻片；离心机手提式自封消毒锅弯头滴管吸量管（1.0、0、5.0毫升）注射器（5毫升，10毫升）针头（7#）细胞培养瓶24孔、96孔培养板（天津产或进口）酒精灯120目钢丝网9cm平皿50ml带盖塑料离心管100毫升三角瓶、青毒素小瓶烧杯（100，500，1000毫升）微滤器1000毫升正压不锈钢滤器微孔滤膜眼科剪、镊脱脂棉、纱布、胶布、卫生卷纸HAT培养基HT培养基无血清培养基15%小牛血清培养基小牛血清乙醇（AR，工业纯）CPBS四、培养基与试剂的配制：1、RPMI-1640培养基的配制；RPMI-1640粉10.4g丙酮酸钠0.11gHepes5.925g三蒸水1000ml磁力搅拦器搅拦3小时，溶解后过滤除菌，在4中保存。2、200mML-谷氨酰胺的配制：L-谷氨酰胺1.461g三蒸水100ml深解后，过滤除菌，分装小瓶，每瓶1ml，在-20保存。4.5%碳酸氢钠（NaHCO3）配制NaHCO35g三蒸水100ml8磅高压灭菌15分钟，在4保存。如分装小瓶，每瓶4.2ml。5、次黄嘌呤及胞腺嘧啶核苷（HT）100倍母液配制：次黄嘌呤（Hypoxanthine，H）102m68.05mg胞腺嘧啶核苷（Thymidine,T）1610-3m19.4mg三蒸水50ml在4550水浴中溶解，过滤除菌，分装小试管中，每管15ml，在-20保存。6、氨基碟呤（A）410-5m1.76mg三蒸水90mlIN氢氧化钠0.5ml溶解后，加入IN盐酸0.5ml中和，补充蒸馏水至100ml过滤除菌，分装小试管内，每管15ml，在-20保存。7、无血清RPMI-1640100mlL-谷氨酰胺200nM（0.2）1.0ml抗菌素（青、链霉素各1万单位）1.0ml5%碳酸氢钠4.2ml8、RPMI-1640完全培养基配制RPMI-1640完全培养液100mlL-谷氨酰胺200mM（0.2m）1.0ml青、链霉素（各1万单位/ml）1.0ml5%碳酸钠4.2ml小牛血清（灭活）15ml9、HAT培养基的配制：RPMI-1640完全培养基100ml100倍HT母液1.0ml100倍A母液0.8ml10、HT培养基的配制RPMI-1640完全培养基100ml100倍HT母液1.0ml11、50%（W/V）聚乙二醇（PEG）液的配制PEG10.0g8磅15分钟，或煮沸20分钟灭菌并且融化，冷至50时加入。RPMI-1640无血清培养基10ml混合均匀，分装小试管内，每管0.7ml，在-4中保存。12、0.15MPH7.2枸橼酸钠-PBS配制：NaCI6.4gKCI0.16gNaHPO4H2O2.32gKH2PO40.16g枸橼酸钠7.6g二蒸水1000ml分装在100ml瓶中，每瓶50100ml，8磅15分钟高压灭菌后，在4保存。13、20%二甲基亚矾（DMSO）细胞保存液的配制（按体积计算）：小胎牛血清5份RPMI完全培养基3份二甲基亚矾（DMAO）2份混匀，在4保存，不必过滤除菌或高压清毒二甲亚矾，因它也是有毒的以至于自身是无菌的。14、8-氮鸟嘌呤100倍母液的配制8-氮鸟嘌呤1152mg0.36%NaHCO21.0ml4NNaOH100ml三蒸水100ml过滤除菌，分装小瓶，每瓶1.0ml，在-40保存。15、0.1%伊文氏兰液配制：伊文氏兰液（Fvengs blue）0.1g0.15MPH7.2枸楷酸钠-PBS100ml混匀，4保存，也可配制成1%溶液，保存，使用前再稀释成0.1%。五、实验步骤：1、取末次免疫后的第3天小鼠脾细胞悬液，将108小鼠脾细胞与1-5107SO2/O小鼠骨髓瘤细胞混合于50毫升刻度离心管中，经1000转/分离心7分钟；2、弃上清液，尽可能除得干净，用手指轻叩离心管底部，使沉淀混匀如糊状，离心管置37水中进行水浴（一小烧杯中），准备融合；3、将37水浴中保温的50%PEG1.0毫升（实际应用0.7毫升）用滴管缓慢滴入离心管中，在60秒钟内滴完，在37水浴中边滴边摇边离心管，使细胞保存在混匀状态；4、加完PEG后，将细胞悬液放在37水浴中静置90秒钟，立即在24分钟内加入15毫升无血清的RPMI-1640培养基（37），开始要一滴一滴地加，由于稀释使PEG停止作用。注意尽可能不搅动细胞；5、再经100转/分离心10分钟。弃去上清液，加25毫升HAT培养液，轻轻混匀，将混悬液分装已有巨噬细胞的两个24孔培养板中，每孔0.5毫升；6、将培养板放在水蒸汽饱和CO2孵箱中，37孵育。CO2含量为5%；7、每23天换一次HAT培养液，连续2周观察杂交瘤细胞是否出现。2周后使用HT培养基。六、注意事项：1、细胞杂交瘤的实验全过程必须是在严格的无菌条件下进行，任何一个环节的疏忽均可导致严重污染。因而须严格的无菌操作。2、试剂价格相对昂贵，应注意节省。3、试验中的各个环节，尤其是结细胞融合过程和细胞克隆的筛选工作更为重视。实验五 细胞克隆化培养技术有限稀释法一、实验目的：1、掌握用有限稀释法进行细胞克隆化培养技术；2、学会细胞克隆形成的辩观察技能；3、配合抗体分泌细胞筛选技术，确定抗体分泌细胞。二、实验原理：克隆化培养即单细胞培养技术，用有限稀释法进行杂交瘤细胞克隆化培养，可以及时确定阳性杂交瘤细胞株，同时淘汰因发生染色体丢失或抗体的轻、重链基因分离而出现无抗体分泌阴性细胞株。一般杂交瘤细胞需经过523次反复克隆后，才能达到100%细胞阳性率。该办法亦适用于一般细胞培养中的细胞纯化、突变细胞株的选择，识别和分离。是细胞株的常用方法。三、实验材料：杂交瘤细胞、25毫升培养瓶、96孔细胞培养板（天津有机玻璃厂）、移液管（1毫升、5毫升、10毫升）、弯头滴管、倒置显微镜、CO2培养箱、白细胞计数板、计数器、盖玻片、防水笔、RPMI-1640、小牛血清、青链霉素、10毫升刻度离心管，00橡胶塞，饲养细胞（3-6105/ml、见腹腔细胞的制备）。四、实验步骤：1、分装了每孔0.1毫升腹腔细胞的96孔细胞培养板（可提前24小时准备就绪，置CO2培养箱中备用）；2、自细胞培养瓶中收集长势良好的杂交瘤细胞（亦可自24孔培养板孔中收集），制成悬液。3、按白细胞计数方法准确计得细胞悬液的细胞数，一般在105/毫升左右。4、取3支10毫升刻度离心管排列在超净工作台试管架上，先用无血清培养基将细胞稀释至103/毫升，再用含15%小牛血清的完全培养基稀释到101/毫升细胞，即每0.1毫升1个细胞。5、每孔0.1毫升细胞悬液。6、置375%CO2培养箱，4天后取出观察，并在板盖上打上标记，做好记录并统计结果。7、继续培养时，则在第4-5天更换1/2培养基，约第7-9天可以收获培养液上清用于检测抗体。并重复检测1-2次。8、选择单克隆生长孔，生长良好，阳性强者，转移到24孔板再做克隆经培养或扩大培养。五、实验结果：实验结果以总细胞孔（如96孔）中出现克隆孔统计出克隆百分率，并可进一步按单细胞孔、双细胞孔、多细胞孔分别计算出百分率。六、注意事项：1、注意无菌操作，一旦发现污染（孔）必须及时处理；2、计数细胞要求准确，稀释量亦要准确，否则将造成一孔多细胞克隆或克隆百分离太低；3、在计数克隆出现率之前，不宜更换培养液，也不宜强烈振动培养板；4、做克隆化培养的小牛血清必须是优质血清；5、若做克隆抗体检测时，特别要保护细胞的生长状况，防止细胞生长不良甚至丢失。七、说明：哺乳动物细胞通过分离、稀释接种，培养在适宜于单细胞生长的培养液中，形成细胞克隆。运用这项技术可以制作细胞成活曲线，即在接种相同数量细胞的培养瓶中，加入不同浓度的化学药品，或照以不同剂量的射线，观察其对细胞的听见害程度。由此可以在哺乳类细胞中进行诱变试验及分离突变细胞。实验六 杂交瘤细胞的冷冻保存和复苏技术一、目的：掌握冻存和复苏细胞的技术杂交瘤细胞株一经建立应尽快冻存，以保证杂交瘤细胞不至于因传代污染或因变异而丢失，在克隆化前将抗体阳性的样本冻存，在一旦克隆传代失败或在增殖过程中丢失，还可将保存的杂交瘤细胞重新复苏，继续进行实验。将细胞冻存还可避免繁重的细胞传代工作量以及不明原因的污染和细胞在培养过程中的变异。用于细胞融合的骨髓细胞株也可同样方法保存：以取得稳定可靠的亲本细胞来源。因此，冷冻保存细胞株是杂交瘤研究的一项重要的实验技术。该技术同样适用于一般动物细胞的冷冻和保存。二、原理：主要是城保护下，降低保存温度甚至用深低温（196）保存，借以减低或几乎停止细胞的活力的能量产生机构，从而延长保存期。冷冻保护剂有许多种类，而较普遍采用的是二甲基亚矾（Demathy,Sulfoxide,DMSO）它的作用既能降低细胞的新陈代谢，又能维护细胞膜的强度，使水分不易进入细胞而影响其冷冻保存。三、试剂、器材：1640完全培养基，10%DMSO-1640完全培养基，无血清1640培养基。恒温水浴、液氮罐、玻璃安瓶或带密封盖的塑料小管，装安瓶的小布袋，刻度离心管，胶塞、培养或小培养瓶、小烧杯、细胞计数用器材。四、操作方法：1、细胞悬液配制：取生长旺盛、形态良好的待冻存细胞，用离心法收集细胞，并用冻存培养基将细胞调至3-5106/ml。2、分装：将细胞悬液注入2ml安瓶中或塑冷冻管中，每支0.51.0ml，封紧（安瓶用火焰封口），每只安瓶上标上细胞名称、冻存日期、装入小布袋中。3、缓慢降温，原则上要使冻存细胞瓶的温度每分钟下降1，待降至-60-70时，再将细胞浸没有液氮中，各实验室的操作方法根据细胞的种类和经验略有不同，以下两法均可使用。将细胞管先放置4或普通冰箱冰格内2小时，再移至液氮容器面上，停留30分钟后（约-60-70），再浸入液氮中。将细胞瓶放入壁厚12cm的聚乙烯泡沫塑料盒中（自制），密封后，放在80冰箱中过夜，次日将细胞瓶移至液氮中。亦有人将安瓶放在4冰箱中4小时，再置安瓶于气态氮中20分钟，然后立即放入液态氮中。五、细胞复苏：1、从液氮罐中取出安瓶或其它类型塑料冷冻管，有时冷冻管因未封严，浸入液氮后，取出后安瓶或管子内液迅速气化可以爆炸（力量有限）因此应戴手套和防护眼镜。2、迅速放入装有37-40的热水烧杯中（放在超净工作台内），用镊子夹紧并不时摇动，令尽快融化。3、如用安瓶冷存，取出后，用70酒精擦试消毒后。折断颈部，如用塑料管，则防止融融时渗入水，打开盖子，用吸管吸出悬液，注入离心管中，再补加10毫升培养液（滴加）；或直接滴入装有10ml培养液中（可以用无血清培养液）。4、低速离心（1000转/分）5-7分钟，去上清，一般不再重复用培养液洗一次。5、用培养液适当稀释后，装入培养瓶中或24孔培养板中375%CO2培养箱内培养，次日更换一次培养液后，继续培养。6、以后仍按常规传代培养进行培养。注意事项：1、安瓶或管内冻存的细胞数量要充分，在融解后能允许做1：10-1：20的稀释，最后细胞数量/毫升仍要比一般高一些，一般再培养接种浓度为5104/毫升，因此冻存细胞密度应达到107毫升，在融后稀释20倍后，仍能保持5105/毫升数量。2、加入一定量的饲养细胞有助于复苏细胞成活，饲养细胞的密度一般105/毫升左右。3、一般复苏细胞的成活率在2070%左右。参考资料：章谷生等主编：单克隆抗体医学上的应用 上海科学技术出版社 1987.4柏乃庆编著 人体保存（细胞、组织和器官的保存技术） 上海科学技术出版社 1985.3张和君等编译 单在隆抗体及细胞免疫实验技术 云南科学技术出版社 1986.12刘祖洞等编 遗传学实验（第二版）高教出版社 1987.11实验七 流式细胞仪标本的制备流式细胞仪(FCM)是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断，对淋巴细胞群和亚群进行精确分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。活细胞免疫荧光技术是用于FCM检