第三章毛细管电泳法ppt课件

第三章毛细管电泳法CapillaryElectrophoresis 第一节毛细管电泳概述第二节毛细管电泳基础理论第三节毛细管电泳仪第四节毛细管电泳类型第五节毛细管电泳的应用和进展 第一节毛细管电泳概述 毛细管电泳 CE 又称高效毛细管电泳 是近年来发展最快的高效分离分析技术之一 该技术是现代微柱分离技术和经典电泳技术结合的产物 是气相色谱 GC 高效液相色谱 HPLC 等常用分离技术的重要补充 在诸多研究领域得到了人们广泛的接受和认可 一 毛细管电泳发展历程 1808年 俄国物理学家Pence发现电泳现象 1937年 瑞典Tiselius将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间 两端施以电压进行自由溶液电泳 发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定 第一次从人血清提取的蛋白质混合液中分离出白蛋白和 球蛋白 但分离效率低 1981年 Jorgenson在75 m毛细管内施加300V cm的高强度电场 获得了理论塔板数超过400 000plates m的高分离效率 轰动了整个分离界 成为CE划时代里程碑1989年 毛细管电泳仪问世 1989年 第一届CE国际会议的召开 标志着一门新的分析技术的产生 二 毛细管电泳的特点 1 高效 每米理论塔扳数低则十几万 高则几百万甚至上千万 2 快速 可在十几分钟甚至几十秒内完成分离 3 低样品消耗 只需纳升甚至皮升级样品量 4 低成本分析 只需低廉的分离毛细管和少量的运行缓冲液 CE是现代微柱分离和经典电泳技术有机结合的产物 具有较HPLC和平板凝胶电泳更多的优点 5 高度自动化 CE是目前自动化程度最高的分离分析方法之一 6 洁净 通常用水溶性缓冲液 对人体和环境无害 7 多分离模式 可根据需要在同一仪器上选用不同的样品分离模式 8 应用范围广 具有 万能 分析的功能和潜力 既可以分析无机离子 氨基酸 药物等小分子 又可以分析蛋白质等生物大分子 甚至整个细胞和各种微粒 第二节毛细管电泳基础理论 一 电泳流 电泳 在电解质溶液中 位于电场中的带电离子在电场力的作用下 以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象 电泳时 不同离子在电场中具有不同的定向迁移速度 迁移速度与哪些因素有关 淌度 单位电场下的电泳速度 绝对淌度 在无限稀释溶液中测得的淌度 有效电泳淌度 在实际溶液中测得的淌度 电场强度 与所施加的电压成正比 与两电极间的距离 L 成反比E V L电场力 在溶液中 电场对带电离子作用力 F 的大小等于带电离子所带的净电荷 q 与电场强度的乘积 F q E在电泳迁移过程中 介质粘滞力 F 必然会阻碍离子的迁移 粘滞力的大小与离子大小 形状 缓冲液粘度 甚至电泳介质孔径均有关系 与带电离子的移动速度更是直接相关 对于球形分子F 的大小服从Stokes定律 F 6 r ef 缓冲液粘度 r 球形分子的半径 ef 离子在电场中的迁移速度 当带电离子以速度 在电场中移动时 受到大小相等 方向相反的电场驱动力和平动摩擦阻力的作用 此时F F 故 q E 6 r ef则离子在电场中的迁移速度 即带电离子的电泳迁移速率 或称电泳淌度 由此可知 球形带电离子的迁移率 主要取决于自身状态 即与其所带电量成正比 与其半径及介质粘度成反比 电泳过程中正是利用带电离子电泳迁移速度或迁移速率的差异来实现分离的 二 电渗流 在高电场的作用下 带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动 由于这些阳离子实际上是溶剂化的 故将引起柱中的溶液整体向负极移动 形成电渗流 石英毛细管柱 内壁大约有8 31 mol m2的硅醇基 Si OH 其等电点约为1 5 内充液pH 3时 表面电离成SiO 管内壁带负电荷 形成双电层 1 CE中电渗流的大小与方向 电渗流的大小可用电渗速度和电渗淌度表示 1 电渗流的大小电渗流的大小与电场强度 Zata电势及缓冲液介电常数有关 某一电泳体系内电渗流的具体数值可以用Helmholtz Smoluchowski公式计算 式中 为电渗速度 为电渗淌度 EOFmobility 为双电层的Zeta电位 为缓冲液介电常数 为电解液粘度 V为所施加的电压 为毛细管总长度 在具体实验中 可根据需要选用不同的中性组分作为标记物 N N 二甲基甲酰胺 二甲亚砜 甲酰胺 苯酚 丙酮等 测定不同缓冲条件下中性标记物的迁移时间 按下述公式计算出电渗率 其中 t 中性标记物的迁移时间 ldet为毛细管电泳有效长度 ltot为毛细管电泳有效长度 2 CE中电渗流的方向 石英毛细管带负电荷 溶液带正电荷 电渗流流向阴极 改变电渗流方向的方法 毛细管改性 表面键合阳离子基团 加电渗流反转剂 内充液中加入大量的阳离子表面活性剂 将使石英毛细管壁带正电荷 溶液表面带负电荷 电渗流流向阳极 2 CE中电渗流的流形 液相色谱中的溶液流动为层流 抛物线流型 管壁处流速最慢 管中心处的速度为平均速度的2倍 引起谱带展宽较大 在毛细管电泳中 电荷均匀分布 整体移动 电渗流的流动为平流 塞式流动 谱带展宽很小 故柱效较高 3 CE中电渗流的作用 电渗流的速度一般约等于离子电泳速度的5 7倍 各种电性粒子在毛细管柱中的迁移速度为 阳离子迁移速度 电渗流 电泳流 阳离子运动速度快于电渗流 阴离子迁移速度 电渗流 电泳流 阴离子运动速度慢于电渗流 中性粒子迁移速度 电渗流 中性粒子运动速度与电渗流一致 CE中电渗流的作用 可一次完成阳离子 阴离子 中性粒子的分离 改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性电渗流的微小变化影响结果的重现性 在CE中 控制电渗流非常重要 4 CE中影响电渗流的因素 1 电场强度的影响电渗流速度和电场强度成正比 当毛细管长度一定时 电渗流速度正比于工作电压 2 毛细管材料的影响不同材料毛细管的表面电荷特性不同 产生的电渗流大小不同 3 电解质溶液性质的影响 溶液pH的影响对于石英毛细管 溶液pH增高时 表面电离多 电荷密度增加 管壁zeta电势增大 电渗流增大 pH在4 7之间 电渗流增大显著 pH 8时电渗流增大速度渐缓 当pH 3 毛细管内壁离解的硅醇基被氢离子中和 表面接近电中性 电渗流接近零 分析时 可采用缓冲溶液来稳定并调控pH 阴离子的影响在其它条件相同 缓冲液浓度相同而阴离子不同时 毛细管中的电流有较大差别 产生的电渗流不同 4 温度的影响 毛细管内温度升高 使溶液的黏度下降 电渗流增大 温度变化来自于 焦耳热 焦耳热 毛细管溶液中有电流通过时 产生的热量 CE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导 浓度及电场强度成正比 温度每变化1度 将引起背景电解质溶液黏度变化2 3 5 添加剂的影响 加入浓度较大的中性盐 如K2SO4 溶液离子强度增大 使溶液的黏度增大 电渗流减小 加入表面活性剂 可改变电渗流的大小和方向 加入不同阳离子表面活性剂来控制电渗流 加入阴离子表面活性剂 如十二烷基硫酸钠 SDS 可以使壁表面负电荷增加 zeta电势增大 电渗流增大 加入有机溶剂如甲醇 乙腈 使电渗流增大 三 CE中的参数与关系式 1 迁移时间 保留时间 CE兼具有电化学的特性和色谱分析的特性 有关色谱理论也适用 Vap是表观迁移速度 ap是表观淌度 ldet是毛细管有效长度 ltot是毛细管总长度2 分离效率 塔板数 在CE中 仅存在纵向扩散 2 2Dt 扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高 这是分离生物大分子的依据 3 分离度 四 影响分离效率的因素 区带展宽 1 纵向扩散的影响在CE中 纵向扩散引起的峰展宽 2 2Dt由扩散系数和迁移时间决定 大分子的扩散系数小 可获得更高的分离效率 2 进样的影响当进样塞长度太大时 引起的峰展宽大于纵向扩散 分离效率明显下降 理想情况下 进样塞长度 Winj 24Dt 1 2实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的1 2 3 焦耳热与温度梯度的影响 电泳过程产生的焦耳热可由下式计算 m 电解质溶液的摩尔电导 I 工作电流 cm 电解质浓度 散热过程中 在毛细管内形成温度梯度 中心温度高 破坏了塞流 导致区带展宽 改善方法 1 减小毛细管内径 2 控制散热 4 溶质与管壁间的相互作用 蛋白质 多肽带电荷数多 吸附问题特别严重 是目前分离分析该类物质的一大难题 细内径毛细管柱 一方面有利于散热 另一方面比表面积大 又增加了溶质吸附的机会 减小吸附的方法和途径 加入两性离子代替强电解质 两性离子一端带正电 另一端带负电 带正电一端与管壁负电中心作用 浓度约为溶质的100 1000倍时 抑制对蛋白质吸附 又不增加溶液电导 对电渗流影响不大 第三节毛细管电泳仪 一 仪器主要部件 1 高压电源 1 0 30kV稳定 连续可调的直流电源 2 具有恒压 恒流 恒功率输出 3 电场强度程序控制系统 4 电压稳定性 0 1 5 电源极性易转换 2 毛细管 毛细管是CE分离的心脏 理想的毛细管必须是电绝缘 紫外 可见光透明且富有弹性的 目前可以使用的有玻璃 熔融石英或聚四氟乙烯塑料等 毛细管内径一般为20 100 m 3 缓冲液池 化学惰性 机械稳定性好 4 检测器要求 具有极高灵敏度 可柱端检测 检测器 数据采集与计算机数据处理一体化 类型检测限 mol特点紫外 可见10 13 10 15加二极管阵列 光谱信息荧光10 15 10 17灵敏度高 样品需衍生激光诱导荧光10 18 10 20灵敏度极高 样品需衍生电导10 18 10 19离子灵敏 需专用的装置 二 毛细管电泳的进样方式 进样量 毛细管长度的1 2 纳升级 非常小 1 流体力学进样方式 1 进样端加压 2 出口端抽真空 3 虹吸进样 毛细管一端插入样品瓶 加电压 2 电动进样方式 进样不均 电歧视现象 淌度大的离子比淌度大的进样量大 离子丢失 淌度大且与电渗流方向相反的离子可能进不去 特别适合黏度大的试样 3 扩散进样试样通过扩散作用进入分离柱端口处 第四节毛细管电泳类型 常用的六种电泳分离模式 根据试样性质不同 采用不同的分离类型 每种机理的选择性不同 一 毛细管区带电泳 Capillaryzoneelectrophoresis CZE 带电粒子的迁移速度 电泳和电渗流速度的矢量和 正离子 两种效应的运动方向一致 在负极最先流出 中性粒子 无电泳现象 受电渗流影响 在阳离子后流出 阴离子 两种效应的运动方向相反 电渗流 电泳时 阴离子在负极最后流出 在这种情况下 不但可以按类分离 同种类离子由于差速迁移被相互分离 CZE是最基本 应用广的分离模式 二 毛细管凝胶电泳Capillarygelelectrophoresis CGE 将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶 其具有多孔性 类似分子筛的作用 试样分子按大小分离 能够有效减小组分扩散 所得峰型尖锐 分离效率高 蛋白质 DNA等的电荷 质量比与分子大小无关 CZE模式很难分离 采用CGE能获得良好分离 DNA排序的重要手段 特点 抗对流性好 散热性好 分离度极高 无胶筛分技术 采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺 柱便宜 易制备 1 缓冲溶液中加入离子型表面活性剂 其浓度达到临界浓度 形成一疏水内核 外部带负电的胶束 三 胶束电动毛细管色谱 MECC MEKC Micellarelectrokineticcapillarychromatography MEKC 在电场力的作用下 胶束在柱中移动 2 电泳流和电渗流的方向相反 且 电渗流 电泳 负电胶束以较慢的速度向负极移动 5 色谱与电泳分离模式的结合 3 中性分子在胶束相和溶液 水相 间分配 疏水性强的组分与胶束结合的较牢 流出时间长 4 可用来分离中性物质 扩展了高效毛细管电泳的应用范围 根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术 2 毛细管内充有两性电解质 合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物 当施加直流电压 6 8 0kV 时 管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度 3 氨基酸 蛋白质 多肽等的所带电荷与溶液pH有关 在酸性溶液中带正电荷 反之带负电荷 在其等电点时 呈电中性 淌度为零 四 毛细管等电聚焦Capillaryisoelectricfocusing CIEF 4 聚焦 具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移 分别到达满足其等电点pH的位置时 呈电中性 停止移动 形成窄溶质带而相互分离 5 阳极端装稀磷酸溶液 阴极端装稀NaOH溶液 6 加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测 7 电渗流在CIEF中不利 应消除或减小 1 将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子 充满毛细管 和尾随离子 试样离子的淌度全部位于两者之间 并以同一速度移动 2 负离子分析时 前导电解质的淌度大于试样中所有负离子的 所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进 逐渐形成各自独立的区带而分离 阴极进样 阳极检测 五 毛细管等速电泳Capillaryisotachophoresis CITP 3 不同离子的淌度不同 所形成区带的电场强度不同 E 淌度大的离子区带电场强度小 沿出口到进口 将不同区带依次排序1 2 3 4 电场强度依次增大 假设 2 号中离子扩散到 3 号 该区电场强度大 离子被加速 返回到 2 区 当 2 号中离子跑到 1 号区 离子被减速使之归队 4 特点 界面明显 富集 浓缩作用 在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液 以含有机物的缓冲液为流动相 以电渗流为驱动力 试样组分在两相间的分配为分离机理的电动色谱过程 六 毛细管电色谱Capillaryelectroosmosticchromatography CEC 一 离子分析 阳离子分析迁移方向和电渗流方向一致 4 5min内分离了24种金属离子 阳极进样 阴极检测 具有很高的灵敏度 第五节毛细管电泳的应用与进展 阴离子分析 阴离子电泳方向和电渗流方向相反 速度接近 分析时间长 效率低 质量小 电荷密度大的离子如 SO42 Cl F 等 电泳速率大于电渗流 阳极端流出 在阴极端无法检测 加入电渗流改性剂 十六烷基三甲基溴化胺等 使电泳方向和电渗