【毕业学位论文】(Word原稿)利用微生物发酵床养猪垫料研制生物肥药的研究-应用微生物学与基因工程

分类号： 单位代码： 10389 密 级： 学 号： 1071726 福建农林大学硕士学位论文 利用微生物发酵床养猪垫料 研制生物肥药的研究 学 科 门 类： 理 学 一级学科名称： 生物学 二级学科名称： 微生物 学 研 究 方 向： 应用微生物学 研 究 生： 指 导 教 师： 研究员 完 成 时 间：二 O 一 O 年四 月 he of of on of 2010 独创性声明 本人声明，所呈交的学位（毕业）论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识 产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位（毕业）论文的规定，即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅 ; 学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在 年后解密可适用本授权书。 不保密，本论文属于不保密。 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 指导教 师亲笔签名： 日期： 目 录 中文摘要 . I . 一章 绪论 . 1 1 生物肥药简介 . 1 2 生物肥药菌种的生物学特性 . 2 致病力尖孢镰刀菌的生物学特性 . 2 紫拟青霉的生物学特性 . 2 致病力铜绿假单孢菌的生物学特性 . 3 结芽孢杆菌 株的生物学特性 . 4 短芽孢杆菌 株的生物学特性 . 4 致病力青枯雷尔氏菌的生物学特性 . 5 状芽孢杆菌 株的生物学特性 . 5 3 发酵床养猪垫料简介 . 5 4 脂肪酸生物标记在微生物群落研究中的应用 . 6 5 本课题的立题依据及其研究内容 . 7 第二章 生物肥药菌种在养猪垫料中的培养特性 . 8 1 引言 . 8 2 材料与方法 . 8 料 . 8 法 . 8 3 结果与分析 . 9 致病力 尖孢镰刀菌在养猪垫料上的发酵特性 . 9 紫拟青霉在养猪垫料上的发酵特性 . 10 致病力铜绿假单孢菌在养猪垫料上的发酵特性 . 11 结芽孢杆菌 株 在养猪垫料上的发酵特性 . 12 短芽孢杆菌 株 在养猪垫料上的发酵特性 . 13 致病力青枯雷尔氏菌在养猪垫料上的发酵特性 . 14 状芽孢杆菌 株在养猪垫料上的发酵特性 . 15 4 讨论 . 16 生物接种对堆肥发酵过程的影响 . 16 生物接种对养猪垫料营养成分的影响 . 17 第三章 生物肥药菌种在养猪垫料中数量变化动态 . 18 1 引言 . 18 2 材料与方法 . 18 料 . 18 法 . 18 3 结果与分析 . 20 态学鉴定 . 20 16子鉴定 . 22 因检测 . 22 猪垫料发酵后目标菌数量动态 . 23 4 讨论 . 25 标菌在养猪垫料中存活状况分析 . 25 活目标菌在发酵过程中的数量动态变化 . 25 第四章 生物肥药菌种接种后养猪垫料微生物群落结构 变化动态 . 26 1 引言 . 26 2 材料与方法 . 26 料 . 26 法 . 26 3 结果与分析 . 27 种无致病力尖孢镰刀菌养猪垫料发酵后微生物群落结构动态 . 27 种淡紫拟青霉养猪垫料发酵后微生物群落结构动态 . 28 种无致病力铜绿假单孢菌养猪垫料发酵后微生物群落结构动态 . 30 种凝结芽孢杆菌 株养猪垫料发酵后微生物群落结构动态 . 31 种短短芽孢杆菌 株养猪垫料发酵 后微生物群落结构动态 . 32 种无致病力青枯雷尔氏菌养猪垫料发酵后微生物群落结构动态 . 33 种蜡状芽孢杆菌 株养猪垫料发酵后微生物群落结构动态 . 34 4 讨论 . 36 肥化过程中细菌、放线菌和真菌数量的动态变化 . 36 加接种剂对堆肥微生物群落结构变化的影响 . 36 第五章 生物肥料微生物群落脂肪酸生物标记特性研究 . 37 1 引言 . 37 2 材料与方法 . 37 料 . 37 法 . 38 3 结果与分析 . 39 生物群落脂肪酸生物标记在不同 发酵时间不同处理养猪垫料中的分布 . 39 生物群落脂肪酸生物标记总量的比较 . 47 同发酵时间不同微生物接种养猪垫料微生物各主要类群 对生物量 . 48 生物群落脂肪酸生物标记的聚类分析 . 50 4 讨论 . 51 第六章 生物肥药 . 53 1 前言 . 53 2 材料与方法 . 53 料 . 53 法 . 54 3 结果与分析 . 55 培瓶与菌袋淡紫拟青霉固体发酵试验 . 55 子淡紫拟青霉固体发酵试验 . 56 4 讨论 . 56 第 七 章 结论与展望 . 58 1 结论 . 58 2 展望 . 58 参考文献 . 59 中文摘要 生物肥药是一种新型的微生物肥料，它既具有促进农作物生长的肥效作用，还具有分解有机物、活化土壤、农残降解以及防虫抗病的药效作用。它充分利用固体废弃物进行固体发酵，实现了资源的循环利用。 本文 首先研究了生物肥药菌种在养猪垫料中的培养特性。接种生防 菌后， 堆肥温度 明显上升， 并且 比对照的堆肥温度要高，但二者差异不是很明显。另外，与对照相比较， 变化差异 不是很明显 。 本文还研究了接种 7 株生防菌后，养猪垫料中的微生物群落结构的变化。经形态学观察、因检测和 16子鉴定表明， 无致病力尖孢镰刀菌、无致病力铜绿假单胞菌、 短短芽孢杆菌 致病力青枯雷尔氏菌和蜡状芽孢杆菌 菌种可在没有灭菌的养猪垫料中存活，其中 短短芽孢杆菌 株 达到了 107g。通过传统的稀释平板分离法和磷脂脂肪酸法分析表明，养猪垫料 中的微生物群落非常丰富。不同类型的微生物在养猪垫料中有不同的分布。接种生防菌后，生防菌对细菌和真菌的影响较大，而对放线菌的影响较小。 最后，本文 研究了淡紫拟青霉加工成担子肥药的发酵工艺。淡紫拟青霉是一株可以杀死植物线虫的生防菌。结果显示，它在不灭菌的不添加外来物质的养猪垫料中不能存活；而一旦在养猪垫料中添加速效碳源蔗糖，淡紫拟青霉生长迅速，并且可迅速达到微生物肥料的孢子含量标准 108g. 关键词 ： 生物肥药 ； 生防菌； 养猪垫料； 培养特性 ； 微生物群落结构 ； 担子肥药；发酵工艺； is a as a to of of of It of to of in in of of in of is is In in is of 6be in of 07 g. of in of in of a is a it is in to of he of 08 g. 1 第一章 绪论 随着畜牧业生产规模的日益 扩大，随之产生的大量畜禽排泄物的处理已成为一个亟待解决的新问题。由于畜禽排泄物的处理费用很高，所以有些养殖业主往往把含有畜禽排泄物的污水直接排放入河流、湖泊，导致河水污染以及富营养化，破坏了生态环境。近几年从日本引进并迅速在中国改进、推广、应用的零污染养猪技术 取得了很大的成效。这种主要借助于养猪垫料中特殊微生物的作用，达到降解畜禽排泄物的目的，减少了污染。特别是福建省农科院的刘波研究员提出养猪垫料资源化利用的观点，把养猪利用完的养猪垫料转化为功能微生物的培养基，通过微生物发酵，加工成颗粒功能有机肥药，返回农 田使用，形成资源的循环利用 1。 1 生物肥药 简介 生物肥药是刘波研究员率先提出来的，指在有机肥料中接入具有特定微生物功能的菌种，然后开发成一种既具有生物农药的功效，也有田间肥效的产品 1。 这种把特定微生物接入有机肥开发出产品的报道很多。不过之前研究人员都是统称为生物肥料、微生物肥料。张志红等研究把三株生防菌与腐熟的有机肥结合， 组合成生物复混肥和生物有机肥，将它们施用在香蕉上，研究其对枯萎病病害防治效果 2。 微生物肥料可以按照不同的分类依据来进行分类 。 根据作用特性可分为两类： 第一，微生物接 种剂，即以有效微生物接种到作物根部，通过微生物的生命活动产生肥效或促进生长效应为目的。这种类型以根瘤菌接种剂为代表，包括所有以接种为手段的生物肥料；第 二 ，复合微生物肥料，即将有益微生物与有机肥混合在一起制成的，其中既含有用以接种的有益徽生物，又含有作为促进徽生物活动的有机肥基质 3。 从这个分类定义来讲，刘波研究员提出的生物肥药应该指复合微生物肥料。 根据功能和肥效可分为 ：第一，增加土壤氮素和作物氮素营养的菌肥，如根瘤菌肥、固氮菌肥、固氮蓝藻等；第二，分解土壤有机质的菌肥，如有机磷细菌肥料、综合性菌肥；第三， 分解土壤难溶性矿物质的菌肥，如无机磷细菌肥料、钾细菌菌肥；第四，刺激植物生长的菌肥，如抗生菌肥料、促生菌肥；第五，增加作物根系吸收营养能力的菌肥，如菌根菌肥料。从微生物肥料发展的趋势来看，以复合微生物多功能、适应能力强的生物制剂配合有机肥料生产的有机复合肥，或开发多功能光合菌肥市场前景看好 4 从之前微生物肥料的研究现状来看，具有防虫抗病的具有生物农药的微生物肥料研究还是比较少的。 根据现在已研究开发生产的微生物肥料统计分析发现，其主要有以下作用。第一，产生植物激素类物质刺激作物生长。许多用作微生物 肥料的微生物还可产生植物激素类物质，能刺激和调节作物生长，使植物生长健壮，营养状况得到改善。 研究都表明在植物的生长发育过程中共生微生物产生的植物激素确实起到一定的作用11。 道了微生物产生的细胞分裂素与植物根的生长有很好的相关性 12。 细胞分裂素可促进细胞分裂和细胞体积增大，抑制衰老 13 第二，提高了作物的抗逆性。由于微生物肥料的施用，其 所含的菌种能诱导作物产生超氧化物歧化酶，在植物受到病害、虫害、干旱、衰老等逆境时，消除因逆境而产生的自由基来提高作物的抗逆性，减轻病害；第三 ，增加土壤肥力，这 2 是微生物肥料的主要功效之一。如各种自生、联合、共生的固氮微生物肥料，可以增加土壤中的氮素来源多种解磷、解钾微生物的应 用，可以将土壤中难溶的磷、钾分解出来，从而能为作物吸收利用；第四 ，对有害微生物起到生物防治作用。肥料中的有益微生物生长繁殖，在作物根际土壤微生态系统内形成优势种群，限制了其他病原微生物的生长繁殖机会，有的还有拮抗病源微生物的作用，起到了减 轻作物病害的功效；而且施用微生物肥料可以节约能源，降低生产成本，且其不仅用量少，而且本身具有无毒无害，没有环境污染的特点。 本研究利用养猪垫料研制的生物肥药的目标就是要达到后面两个作用。 2 生物肥药菌种的生物学特性 研制生物肥药 最主要的技术关键是得到和保存优良的微生物菌种，由于目前应用的微生物肥料主要是细菌肥料，而细菌的自发突变性往往会使细菌的生产特性减弱，加之有很多优良基因位于质粒上而易于丢失。目前虽然微生物肥料种类很多，但多数还是传统的固氮、解磷、解钾细菌， 而像具备防虫抗病的生防菌就很少， 有的甚至还在用 酵母菌，缺乏创新的新型高效产品。 福建省农业科学院农业生物资源研究所微生物创新团队长期从事微生物的分离、筛选、鉴定和保藏。并且同时对鉴定的菌株进行了生物学特性、分子生物学特性、发酵条件、代谢产物的生物效应和田间防效的研究。 致病力尖孢镰刀菌的生物学特性 尖孢镰刀菌 (存在于 各种土壤中，也存在于植物根际，即使在北极的永冻层和撒哈拉沙漠的沙子中也可分离到。尖孢镰刀菌致病菌能侵入植物根部引起根腐或侵入植物维管束系统导致植物萎蔫枯死；其他菌株虽然能够侵入根部但不能侵入 植物维管束系统或引起病害。尖孢镰刀菌包括非致病菌、植物致病菌以及人类致病菌，除了草和大多数木本作物，大多数栽培作物都是致病菌的寄主。尖孢镰刀菌的致病菌株可使许多重要经济作物发生病害，并常导致严重的经济损失 (大豆、棉花、香蕉和咖啡等 )。 尖孢镰刀菌的防治主要是通过化学防治和抗病育种，化学防治污染环境，应用抗病品种是最有效、对环境最安全的防治方法，但现在农业生产中行之有效的抗病品种却很少。所以各国植病专家们致力于生物防治镰刀菌病害，有效防治尖孢镰刀菌病害的非致病菌已经从健康的植物茎部分离出来。早在 1991年吴荣 昌等把尖孢镰刀菌的弱致病菌株的孢子悬浮液接种到黄瓜 4叶期的幼苗上， 诱导黄瓜对枯萎病产生抗性 14。 刘喜梅等归纳了非致病力尖孢镰刀菌在防治致病病株的作用模式主要包括直接拮抗作用、间接拮抗作用 15。 目前，非致病性尖孢镰刀菌在防治尖孢镰刀菌病害中已经得到了广泛 的应用 。非亲和 0号小种接种鹰嘴豆 ,3接种非致病菌延迟了症状发生，并明显降低 5号小种引起的镰刀菌 枯萎病的最终发病数量，在苗期接种非致病菌可提高高丽槐素和美迪紫檀素 (植物抗毒素 )的合成，也能引起植物根部几丁质酶、 316。 紫拟青霉 的生物学特性 淡紫拟青霉 (泛分布于世界各地，具有功效高、寄生广、易培养等优点，特别在控制植物病原线虫方面功效卓著。半个多世界以来，国内外许多专家 3 学者对此菌进行了广泛而深入的研究，在生物学、生态学、大量培养、控害效能与田间应用等方面取得了一系列研究成果。 淡紫拟青霉 对营养条件要求不高，它不仅 能在多种常规培养基上生长，而且能在多种自然基质，如农副产品废料、废渣与植物叶片或植物浸提液中生长 17相关研究表明：菌体生长的最适 为中性偏酸，在碱性培养基上生长缓慢；此菌在 15能正常生长，在 24条件下生长最为迅速，产孢量最大；湿度对孢子萌发至关重要， 到 85%时，孢子才开始萌发， 98%25 时，孢子萌发的速率最高；含 培养基能刺激菌体细胞内酶的产生并增加酶的活性，当培养基中添加可溶性淀粉时，能增加此菌对化学合成物的溶解作用。 淡紫拟青霉 施用用到土壤中能引起土 壤菌系的明显变化，土壤中多种习居菌会抑制 淡紫拟青霉 孢子的萌发，同时此菌也会抑制土壤汇总其它菌类如放线菌。孙漫红报道了大豆田施用淡紫拟青霉菌剂对根围菌系的影响。在施用的第 1周内，根系微生物的种类明显减少，真菌、细菌和放线菌分别减少 16%、 27%和 37%， 4 周后菌系趋于平衡，菌剂对大豆根部有一定亲和能力，可以再根围或根内定殖 21。 淡紫拟青霉的生防功能主要表现在三个方面：第一，对植物病原线虫的寄生作用。淡紫拟青霉对植物根结线虫的寄生作用是秘鲁国际马铃薯研究中心的 先发现的，并在 1979 年首次 报道，该菌是南方根结线虫与白色胞囊线虫卵的有效寄生菌，对南方根结线虫卵 寄生率搞到 60%第二，对昆虫的寄生作用。据文献资料， 淡紫拟青霉可寄生半翅目的荔枝蝽蟓 22、稻黑蝽；同翅目的叶蝉、褐飞虱；等翅目的白蚁 23；鞘翅目的甘薯鼻虫 24、鳞翅目的茶蚕、灯蛾 25还有双翅目的伊蚊等 26。 从生理功能上来讲， 淡紫拟青霉主要有促进植物生长、产生多种功能酶和降解效应。 致病力铜绿假单孢菌的生物学特性 铜绿假单胞菌（ 称绿脓杆菌。在自然界分布广泛，为土壤 中存在的最常见的细菌之一。 其 形态为直或稍弯、两端钝圆的杆菌，大小 1 3 根单端鞭毛，运动活泼。临床分离的菌株常有菌毛和微荚膜，不形成芽胞。 革兰染色阴性。专性需氧菌。最适生长温度 35 ，在 41 也能生长。在普通培养基上生长良好，菌落大小不一，平均直径 23平，边缘不整齐，且常呈相互融合状态。由于本菌产生水溶性色素，使培养基被染 成蓝绿色或黄绿色。在血琼脂平板上菌落较大，有金属光泽和生姜气味，菌落周围形成透明溶血环。在肉汤中形成菌膜，肉汤澄清或微混浊 , 菌液上层呈绿色。培养在 碱性环境中，有自溶现象。 以铜绿假单胞菌属细菌作为生防菌防治植物