【毕业学位论文】(Word原稿)柑橘木虱内生细菌群落结构及影响因素的研究-微生物应用与基因工程

福建农林大学硕士学位论文 1 分类号： 单位代码： 10389 密 级： 学 号： 1101737 福建农林大学硕士学位论文 柑橘木虱内生细菌群落结构及影响因素的研究 学 科 门 类：理学 一级学科名称：生物学 二级学科名称：微生物学 研 究 方 向 ： 微生物应用与基因工程 研 究 生： 指 导 教 师： 研究员 完 成 时 间：二 O 一二年一月 福建农林大学硕士学位论文 2 he of 2013 福建农林大学硕士学位论文 3 独创性声明 本人声明，所呈交的学位（毕业）论文，是本 人在指导教师的指导下独立完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位（毕业）论文的规定，即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅 ; 学校可以公布论文的全部或部分内 容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在 年后解密可适用本授权书。 不保密，本论文属于不保密。 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 指导教师亲笔签名： 日期 福建农林大学硕士学位论文 4 目录 中文摘要 录 第一章 绪论 1研究背景 2研究现状 虫 内共生菌及其与寄主相互关系 研究 3研究方法与技术 6 S 因序列分析的应用 时荧光定量 4本研究的目的和意义 5本研究的技术路线 第二章 柑橘木虱内生细菌培养基的优化和鉴定 1 引言 2材料与方法 筛选 6s 3结果与分析 福建农林大学硕士学位论文 5 6s 橘木虱内生细菌生理生化鉴定 4讨论 第三章 寄主不同器官和木虱内生菌的研究 1 引言 2 材料和方法 、茎、叶）内生细菌的分离 6S 定 同器官和木虱内生细菌的相关性分析 3结果与分析 同器官和木虱内生细菌的分离与鉴定 同器官和木虱内生细菌相关性关系 第四章 柑橘木虱内生菌 1引言 2材料和方法 3结果与分析 木虱内生菌 4讨 论 第五章 木虱内生细菌多样性及实时荧光定量检测 福建农林大学硕士学位论文 6 1 引言 2材料与方法 3结果与分析 橘木虱内生 细菌多样性 6S 6统发育树分析 株标准曲线的制备 4 讨论 第六章 展望 附录 参考文献 福建农林大学硕士学位论文 7 中文摘要 本文主要通过微生物传统分离鉴定和分子生物学方法相结合研究柑橘木虱内生细菌群落结构以及不同品种柑橘内生细菌与木虱内生细菌的相关性，并对不同温度处理过的木虱内生细菌 行实时荧光定量分析，期望为柑橘木虱的防治奠定基础。主要有以下研究结果： 在各种试验操作条件、培养条件一致的情况下，通过 正交试验 34）筛选优化木虱内生细菌分离培养基，结果表明，在所设计的各种影响因素、水平中，分离柑橘木虱内生细菌最佳的培养基配方为培养基为 淋巴为柞蚕血淋巴、生理盐水浓度为 0。利用这种培养基可以分离出尽大可能多的柑橘木虱内生细菌。 根据菌 落形态的差异，将正交试验中分离到进行初步分类的柑橘木虱内生细菌通过纯化培养，提取细菌 行 16s 定。内生细菌经鉴定分别为 木糖葡萄球菌 （ 葡萄球菌属 （ 、 芽孢杆菌属 （ 、不可培养肠杆菌属（ 、 短小杆菌属 （ 、 微杆菌属 （ 、嗜麦芽寡养单胞菌（ 柠檬色短小杆菌（ 利用优化后 2个随机选取的柑橘品种的不同部位的内生细菌以及其上面的五龄木虱内生细菌进行分离鉴定，分析其相关性，结果表明 参考 3种昆虫 取方法和试剂盒法提取木虱内 生菌 通过利用原核生物细菌 16s 用引物特异性地将内生细菌 增出来，结果显示，改进的 3种方法提取的总 整性较低， 增需要进一步摸索。 剂盒法提取 的总 度相对较低，但是浓度为 12 15 L， 1增产物可以很好的进行克隆测序。由于 剂盒法提取柑橘木虱内生菌 作简单，结果稳定，纯度高，重复性好，节省时间，所以针对木虱内生菌总 剂盒提取法应为首选方法。 利用效果较好的试剂盒法提取木虱内生细菌 过分子生物学技术以 16果显示随机挑取的 100 个克隆子进行测序比对分析后， 11 个克隆子经 16S 定为 15 个为 16 个为 63 个为 别为 1 个，最高相似度分别为 99%、 100%。系统发育树分福建农林大学硕士学位论文 8 析结果为 建的标准曲线判定系数分别达到 在 上， 说明模板浓度与 之间呈非常良好的线性关系，回归方程分别为为 一 + 一 + 木虱体内 均含量成虫与若虫及温度处理后的成虫木虱平均含量差异显著，若虫和处理后成虫体内平均含量差异显著，同一龄期成虫 250C 处理结果与 350C 处理 1d、 3d 后结果差异不显著，但与处理 5d 后差异显著。 成虫与若虫体内含量差异不显著，但与同一龄期成虫处理后差异显著。同一龄期温度处理后差异不显著。本研究将传统的微生物分析技术和分子生物学技术相结合，多方面探索柑橘木虱内生细菌群落结构及相关性因素，为柑橘木虱和柑橘黄龙病的生物防治提供新思路和理论依据。 关键词：柑橘木虱；内生细菌；群落结构； 16因；实时荧光定量 建农林大学硕士学位论文 9 by of of by we to a 9 (34) to of in of SB is to of on of 6s NA SB to 2 of of on to - - - - - - - to 6s of to NA CR a NA is 2 15 L, it be L. be to NA so in of of NA be NA by 6NA to 00 11 6 s 15 16 63 建农林大学硕士学位论文 10 9% 00%, - - - - - - - of it t t = t = x + in of of by a is 50C no d, 3 d 50C, d. no of by to in of a of 16NA 建农林大学硕士学位论文 11 第一章 绪论 1 研究背景 橘黄龙病的发生及危害 柑橘黄龙病 (导致柑橘减产最后死亡的一种世界性的严重的病害，具有毁灭性 (邓超， 2010；孙大光， 2012)。在不同国家 (地区 )，该病曾有不同的名称，中国大陆称为黄龙病，台湾称为立枯病 (1，印度称为梢枯病 (菲律宾称为叶斑驳病 (，印度尼西亚称为叶脉韧皮部退化病 ( ，南非称为青果病 ( 等。 1995 年，在中国福建省福州市召开的国际柑桔病害会议中，决定不用 青果病 这一名称，统一称该病害为 黄龙病 (胡文召，周常勇 2010 )。 我国最早在 1919 年广东省潮汕地区发现了柑橘黄龙病（赖传稚，忠文，黎起秦， 2003）。 1950 年后，柑橘黄龙病在广东等地柑橘主产区蔓延开来； 1970 1980 年间，在国内其他个别产区也被陆续发现，其对柑橘产量为害程度不断加重（白华菊，龙梦玲 2009）。柑橘黄龙病不但在我国发生，已知的有近 40 个不同的亚洲、非洲、欧洲、南北美国家都发生了柑橘黄龙病（ 2006）；该 病在多个国家的发生造成了柑橘世界性的减产。 柑橘黄龙病是对于世界柑橘产量造成最具毁灭性的病害。柑橘一旦感染黄龙病，会形成均匀黄化型或着斑驳型黄梢，后期就会表现为一系列症状 缺锌状花叶等，直接表现经济寿命短、果品质低劣、产量低 , 造成严重的经济损失（范国成 , 刘波 , 吴如健 , 李韬 , 蔡子坚 , 柯冲 , 2009）。至今，柑橘黄龙病菌还不能人工培养，主要通过控制传播媒介木虱和生物控制来防治，由于木虱品种的不同和生物防治的局限性，许多国家不能通过防治木虱和生物防治进行有效的消除柑橘黄龙病的危害 ( 1993)。具有柑橘癌症之称的柑橘黄龙病，目前，主要通过挖除病株，加强检疫防疫、严防木虱来阻止黄龙病给柑橘产业造成的损失（ 邓铁军， 2005）。 橘黄龙病病原 研究发现，引发柑橘黄龙病的是一种生活在韧皮部难培养的杆菌微生物，目前主要有三个种：亚洲种 (非洲种 ( 和美洲种（ 目前还没有发现一种基于植物的以一个宿主特定于黄龙病的反应系统为基础的诊断方法（ 2008）。 早期，关于黄龙病的病原问题，有过很多争论。 20 世纪 60 年代前期，有人根据黄龙病病树中经常检测到有柑橘衰退病毒 ( 的存在，认为中国台湾的立枯病、印度的梢枯病和中国大陆的黄龙病的病原是柑橘衰退病毒（ 1963; 陈延熙，梅汝鸿 , 1965） 。 60 年代中期，有人试验证实印尼叶脉韧皮部和非洲青果病退化病通过嫁接能够传染，因此认为病原是病毒病（ 1965; 1965）， 70 年代末期，我国研究人员观察到病原的存在，把它称为类立克次氏体； 80 年代初中期，研究人员再把它归属于类细菌（ 薄壁型细菌（张景宁 , 刘仲健 , 1994）。亚洲黄龙病福建农林大学硕士学位论文 12 病原 ( 和非洲黄龙病病原 ( 通过 16隆测序并在 据库进行序列比对后，进一步证实黄龙病的病原菌是细菌（ 1994）。研究还发现中国黄龙病与非洲青果病在传播媒介、血清学方面和热敏感性流行区域都存在一定的差异，分别称为亚洲型和非洲型（孙大光 , 2012）。 橘黄龙病的传播 黄龙病的传播途径主要是病株与健康植株间的嫁接传播、病树接穗繁殖、接穗和病苗的远距离传播以及柑橘木虱通过刺吸病株携带黄龙病菌后再次刺吸健康植株进行传播。其中木虱是重要的传播媒介，木虱 传播是最重要的一条途径。另外，黄龙病病原还能够通过菟丝子寄生进行传播，但是不能够通过与汁液的磨擦和与土壤接触进行传播（ 莫元妹 , 2009）。 2 研究现状 橘木虱研究现状 柑橘木虱（ 昆虫纲同翅目（ 虱科（ 成虫个体小，长约 3 体为青灰色、有灰褐色斑点 ,体被有白粉。前翅半透明 ,散布褐色斑纹，翅缘颜色较深；腹背灰黑色，腹面浅绿色，在生殖期间腹部橙黄色，足灰黄色，跗节 2 节，末节黑色（李丽萍 , 2009）。柑橘木 虱主要包括非洲柑橘木虱（ 亚洲柑橘木虱（ 其中，非洲木虱主要在非洲地区分布，亚洲柑橘木虱在亚洲和美洲等地区分布广泛。 20 世纪初，我国的木虱主要在广东、广西、福建、台湾等省分布。由于全球性气候变暖，木虱逐渐北迁，目前已经在四川、江西、 湖南、贵州等地蔓延（杜丹超 , 鹿连明 , 张利平 , 胡秀荣 , 黄振东 , 陈国庆 , 2011）。 柑橘木虱的主要寄主是柑橘和芸香科植物，它不但是一种重要的虫病害，还是传播柑橘黄龙病的唯一自然 媒介。成虫、若虫在柑橘嫩梢、幼叶、新芽上吸食为害，造成嫩梢幼芽干枯萎缩 ,新叶畸形卷曲（李丽萍， 2009）。木虱一旦取食黄龙病病株，就会终生携带黄龙病病原，带毒木虱取食 24h 后就可以传毒。黄龙病的传播速度取决于柑橘木虱的数量，两者成正比关系（袁辉 , 李安国 , 2007）。柑桔木虱是唯一一种非人为因素的传病媒介，只要田间没有木虱，既使有黄龙病病株存在，该病原也不会传播（邓明学 , 2006）。 柑橘黄龙病是柑橘最严重的病害。由于黄龙病菌到目前为止还不能人工培养，植株如果感染发病，就会直接造成果实产量下 降，品质变差，经济生产价值大打折扣，至今还没有彻底消除该病菌的方法（ 2004）。赵学源（ 2008）阐述了广东杨村柑橘农场防治黄龙病大发生的经验，把严格防治柑橘木虱作为治理黄龙病的一项关键性措施。 目前，防治柑橘木虱的方法主要包括农业防治、 化学防治和生物防治等。我国目前主要还是以应用化学防治方法来防治木虱，新梢期是木虱发生高峰期，在此期间化学防治效果是最明显有效的。但化学农药频繁的使用，导致生态环境污染 、农药残留、次要害虫猖 撅 ,柑桔木虱抗药性增强。国外，生物防治是有效控制柑桔木虱的措施之一。福建农林大学硕士学位论文 13 生物防治主要通过天敌昆虫的控制和病原微生物对木虱的控制实现木虱危害的防治，该防治方法既能有效的控制木虱，又减少生态环境污染，最终达到生物安全的要求。虽然提倡利用天敌，但还是要慎重，避免它带来的负面影响（章玉苹 , 李敦松 , 黄少华 , 张宝鑫 , 2009）。病原微生物防治木虱具有良好的发展前景，已有研究发现木虱病原真菌如拟靑霉属的宛氏拟青霉（ 白僵菌属的球孢白僵（ 、笋顶孢霉属蚜笋顶孢霉（ 、镰孢属黄色镰孢（ 匐柄霉属匐柄霉（ 、枝孢属尖孢枝孢菌（ 等都有使柑橘木虱致病的作用（陈祝安 , 曹光照 , 许益伟 , 黄基荣 , 葛岚屏 , 1985)。因此，大力探索柑橘木虱生物防治是未来防治木虱的一重大课题，是实现木虱可持续防治的一种趋势。 虫内生菌研究现状 虫内共生菌及其与寄主相互关系 昆虫体内存在大量的 微生物，二者共生早已是种普遍的现象。昆虫食物往往缺乏一种甚至多种生存不可缺少的营养物质，这些营养素可能被其体内微生物补足，补足营养素主要是通过其生物合成活动（ 1985），这就使昆虫在进化过程与微生物趋向于形成一种内共生的关系，特别是同翅目（主要有蚜虫、木虱、粉虱、介壳虫和蝉）和鞘翅昆虫尤为明显（ 1965）。内共生菌（ 由一个自由体演变而来的。内共生菌的结构与功能和线粒体、叶绿体相似，在宿主胞外单独复制，有单独的 白质合成系统，不受宿主 防卫机制的干扰（ 1981）。 内共生菌分为初生内共生菌（ 次生内共生菌（ 它在昆虫体内分布十分广泛，几乎所有的昆虫体内都有内共生菌。 1887 年，蟑螂的内共生菌首先被发现，为丘氏蟑螂杆菌（ 象鼻虫体内也存在这一类内共生菌（ 991）。已有研究表明，在新热带区， 16以上的昆虫体内有 共生，它在共生细菌类群中分布可能是最广的、丰度最大的内共生菌 ( 龚鹏 , 沈佐锐 , 李志红 , 2002)。 内共生菌与宿主之间是相互影响、相互依赖、互惠共生、协同进化的关系。节肢动物许多都是依赖其内共生菌提供必需物质来补足营养（ 谭周进 , 肖启明 , 谢丙炎 , 杨宇红 , 冯兰香 , 2004）。褐飞虱内共生菌自身有高活性的尿酸酶，这种酶利用寄主的代谢物尿酸合成必需氨基酸促使昆虫生长发育，褐飞虱腹部脂肪体细胞的内共生菌则能够合成所需蛋白质以供胚胎和胚后发育，促进胚胎腹节分化（ 1996）。布赫纳氏菌（ 宿主蚜虫提供多种必需氨基酸，内共生菌也可能为蚜虫提供植物细胞壁分解酶、必需的营养物质或共生素蛋白促使若虫发育。去除共生菌蚜虫不能合成体内蛋白（李献辉 , 李保平 , 2006）。类酵母共生菌（ 在于稻飞虱脂肪体细胞，提供稻飞虱自身不能合成的营养物质（包括必需氨基酸、脂肪酸、固醇类等）；至今还没有发现无菌个体稻飞虱，减少飞虱体内酵母菌数量，其生长发育会出现延迟，存活率、羽化率、产卵量下降等现象（王国超 , 傅强 , 张志涛 , 2005）。蟑螂的内福建农林大学硕士学位论文 14 共生菌能够产生尿酸降解酶等来代谢蟑螂体内的氮素废弃物。初生内共生菌对宿主昆虫的生存和生育是必要的，次生内共生菌对宿主并不重要，烟粉虱初生内共生菌给宿主烟粉虱提供特定的营养物质，对烟粉虱的适应性、携毒的可能性、生物型具有影响。内共生菌产生的 白保护病毒体内的运输，因此其对昆虫传播植物病毒也是必要的（谭周进 , 肖启明 , 谢丙炎 , 杨宇红 , 冯兰香 , 2005）。 研究 线虫及节肢动物门体内广泛存在，是一种共生细菌，最早由 库蚊 巢中发现， 1936 年正式定名为 龚鹏 , 沈佐锐 , 李志红 , 2002）。 1971 年， 现 W. 蚊子中引起杂交不亲和，也就是体内不含 雌蚊的卵接受含 雄蚊授精后，受精卵存活不了（ 1973）。此后随着研究的展开， 渐被一些生物学家关注。 仅分布广泛，对宿主还有非常不一般的影响。它能够影响宿主的生殖行为，出现细胞质不亲和（ 诱导雌性化（ 诱导孤雌生殖（ 现象，且能够把这些现象垂直传递下去（ 施婉君 , 程家安 , 2002）。由于上述 宿主的生殖调控作用，有学者提出通过对 人为控制来改变宿主的生殖力，从而减少甚至消除害虫。 昆虫内共生菌的研究为植物病原的防治提供新的方法，内共生菌的减少或消除会导致病害的死亡或降低传毒的能力和效率（谭周进 , 肖启明 , 谢丙炎 , 杨宇红 , 冯兰香 , 2005） 虱内生菌研究现状 同翅目类昆虫主要包括蝉、飞虱、蚜虫、介壳虫、木虱等，是一个具有高度进化的微生物内共生菌系统的昆虫群体，很多情况下，这些昆虫拥有一个较大的器官，一个含菌 细胞（ 由内共生菌的独特的含菌细胞组成 , 在细胞中潜伏着微生物群体（ 1965）。因为同翅目昆虫终生依靠吸取营养不均衡的植物汁液为食，所以它们需要内共生微生物的帮助来弥补其营养不足的缺陷。事实上，已有研究证明同翅目内共生微生物参与宿主代谢过程，如必需营养物质的合成和废弃物氮的循环利用（ 1995; 1989; 1996; 1998）。 在木虱腹部有一个大的、黄色的含菌体，该含菌体是由一个复杂的三种细胞组成的，包裹着许多单核的含菌细胞、合成组织和一个由许多扁平细胞组成包 围。这个含菌体胞质内富含一种独特的微生物，称为 初级内共生菌，合胞体的胞浆充满了另一种类型的细菌称为 级内共生菌（ 1937; 1965; 1969; 1987; 1998; 1998）。另外，已报道木虱的含菌胞共生体和合胞体共生体属于 变形菌纲（ （ 1998; 1998）。 除了含菌共生体，很多同翅类还含多种类型的兼性共生微生物，如蚜虫体内的立克福建农林大学硕士学位论文 15 次氏体（ 1997），灰飞虱体内的沃尔巴克氏体属（ 1995），介壳虫体内螺原体（ 2000）等 , 使其共生微生物更加的复杂。目前的研究只发现了柑桔木虱体内存在合胞共生体（ 含菌体（ 桔黄龙病菌（ 沃尔巴克氏体（ 5 种内共生菌微生物（ ; 2008） 。 共生体，尤其 于控制柑橘木虱是一个可行的办法，因为已有研究证明够感染木虱（ 2000）。 它可以用来通过传播来影响宿主定向能力或通过干扰宿主健康、影响植物病原体调节寄主免疫系统和抗菌产品。 已经报道的 沃尔巴克氏体（ 自然种群蚊子中降低寄主昆虫健康和减少病原体的传播的成功证明了使用这一方法具有可行性（ C 2013）。 橘内生细菌研究现状 早期对于植物内生细菌的研究主要是对健康植物体内微生物存在与否进行论证。自1876 年 取无菌葡萄果汁后才开始了植物内生细菌的研究（刘云霞）。 1992 年，首次提出了植物理内生细菌的概念，认为植物内生菌是指能够定殖在植物细胞间隙或细胞内，并与寄主植物建立和谐联合关系的一类微生物（胡桂萍）。研究发现植物内生菌广泛存在，地球 300000 种植物中都有内生菌的存在（ 2004）。随着不同植物的根、茎、叶、花、果实等器官中 大量的内生细菌被更多的研究者分离出来 ,人们才对内生细菌的研究逐渐地重视起来（冉国华 , 张志元 , 2004）。 研究发现有些植物内生细菌使植物获益，如固氮（ 1998），促进植物生长（ 1997）或诱导植物抗病性（ 1996）等。 目前对柑橘内生细菌也已开展了很多的研究。罗永兰等从 3 种柑橘的不同器官中分离到 75 份内生细菌，分别为气芽孢杆菌属（ 、气单胞菌属（ 、芽孢杆菌属（ 、黄单胞杆菌属（ 、假单胞杆菌属（ 、土壤杆菌属（ 、乳杆菌属（ 。且出现的频次不同（ 罗永兰 , 张志元 , 喻珺 , 2006）。 分离柑橘内生细菌，其中一株 2004）。袁红旭等筛选出 4 株对柑橘炭疽病具有拮抗作用的内生细菌，其中1 株菌能够促进幼苗生长（ 袁红旭 , 陈勇明 , 何财能 , 罗冬萍 , 许丹阳 , 2005） 。张翼等从柑橘枝条中分离到 26 株对油菜菌核病菌（ 有拮抗作用的内生细菌，其中 株的拮抗活性最强。经鉴定 株为枯草芽孢杆菌（ 张翼 , 白晨 , 冉国华 , 张志元 , 陈耀辉 , 吴刚 , 2009）。内生细菌对于寄主的重要性 已被认识到 , 保护植物防治害虫，包括昆虫、线虫、植物病原菌、细菌等；还可在寄主内引起生理上的修饰，比如使它们更耐氢气压力；一些内生细菌还能产生多种生物技术价值如抗生素和抗癌抗生素（ 2000）。研究柑橘内生细菌及其与寄主的相互关系为柑橘生产、生物防治等的应用奠定基础。 3 研究方法与技术 福建农林大学硕士学位论文 16 交试验优化木虱内生细菌培养基 正交试验设计方法于 20世纪 60年代初由日本传到我国。 8 0年代初，田口玄一 3次优化设计该法后在中国得到广 泛的运用。 正交试验设计法是一种用正交表安排多因素多水平试验的方法， 统计学家通过一系列的表格实现正交设计，这些表叫正交表。具有完成试验要求 所需的实验次数少、数据点的分布很均匀、可用相应的极差分析方法、方差分析方法、回归分析方法等对试验结果进行分析，得出有价值的结论的特点。科学合理地进行正交试验设计，既可获得质量高、可靠性高的试验数据和试验产品，在试验数据分析中，还更有利于我们掌握试验对象相互间内在的联系、最佳掺量以及最佳工艺。正交试验试验次数少，能够获得满意的结果，多快好省、事半功倍，既节省了人力、 物力、财 力，又可获得比较良好的技术经济效益。正交最优化设计是处理多因素、多水平问题的好方法，对于该类问题，它无疑是最佳选择。 6 S 因序列分析的应用 16S 原核生物的一种核糖体 细菌分类学研究最有用、最常用的分子钟，且种类少，含量大，在所有生物中都存在，进化