脉冲射频对糖尿病神经痛大鼠腰交感神经节表型转化的影响.doc

脉冲射频对糖尿病神经痛大鼠腰交感神经节表型转化的影响 史竺盎登堂鏊查!生!旦箜!鲞笙!塑堡!垫皇!塑!型尘里!型!翌!Q!y!脉冲射频对糖尿病神经痛大鼠腰交感神经节表型转化的影响郑雪琴谭嘉琦何万友贺俭仲吉英王汉兵佛山市第一人民医院麻醉科528000通信作者王汉兵，Emailfswhbing163疼痛诊疗与研究【摘要l目的评价脉冲射频对糖尿病神经痛大鼠腰交感神经节表型转化的影响。 方法清洁级健康成年雄性sD大鼠24只，2月龄，体重180220g，采用随机数字表法分为4组(rt=6)对照组(c组)、糖尿病神经痛组(PDN组)、脉冲射频组(PRF组)和脉冲射频对照组(PC组)。 采用腹腔注射链脲佐菌素60mgkg的方法制备大鼠糖尿病神经痛模型C组腹腔注射枸橼酸枸橼酸钠缓冲液6mllkg，PC组只进行射频针穿刺，PRF组对右侧k椎旁的腰交感神经节行脉冲射频。 于腹腔注射前(T。 )、脉冲射频前(T。 )、脉冲射频后1?357和14d(T。 )时测定机械缩足反应阈(MWT)，随后处死大鼠取术侧k交感神经节，采用免疫荧光双标法检测酪氨酸羟化酶(TH)和囊泡膜谷氨酸转运体2(VGLUT，)的表达，光镜下观察病理学结果，计数表达VGLUT的神经元数量。 结果与c组比较，PDN组、Pc组和PRF组T，。 时MWT降低，T6时表达VGLUT2神经元数量增加(P005)；与PDN组和PC组比较，PRF组T2。 时MWT升高，T6时表达VGLUT神经元数量减少(P005)。 c组腰交感神经节见TH表达，未见VGLUT表达；其余3组腰交感神经节见TH和VGLUT表达，尤其以PDN组和PC组明显；多数表达VGLUT，神经元同时可见TH表达。 结论脉冲射频减轻大鼠糖尿病神经痛的机制与抑制腰交感神经节表型转化有关。 【关键词】脉冲射频术；腰交感神经节；糖尿病；神经痛；神经节，交感；表型基金项目国家自然科学基金面上项目 (8177052225)；广东省自然科学基金(xxA030313587)DOI1037601cmaJissn0254-1416201902022Effect ofpulsed radiofrequencyon phenotypic transformation oflumbar sympathetic ganglion in ratswith diabetic neuropathic painZhengXueqin，Tan Jiaqi，He Wanyou，He Jian，Zhong埘昭，Wang HanbingDepartment ofAnesthesiology，First Peoples Hospitalof Foshan，Foshan528000，ChinaCorresponding authorWangHanbing，Emailfiwhbing163con【Abstract】ObjectiveTo evaluatethe effectofpulsed radiofrequency(PRF)on thephenotypictransformation of the lumbar sympatheticganglion(LSG)in therats withdiabetic neuropathic pain(PDN)MethodsTwentyfour cleangrade healthyadult maleSprague-Dawley rals，aged2months，weighing180220g，were dividedinto4groups(n=6each)aording tothe methodof randomnumber tablecontrol group(group C)，group PDN，group PRF，and PRFcontrolgroup(group PC)The PDNmodelwas establishedby intraperitonealinjection ofstreptozotocin60mgkg inanesthetized ratsCitratesodiumcitrate buffer6mlkg wasintraperitoneally injectedin group CGroup PConly receivedradiofrequency nee-dh puncturePRF Wasperformed onthe rightL3LSG in group PRFThe mechanicalpaw withdrawalthreshold(MWT)to vonFrey filamentstimulation wasmeasuredbefore intraperitonealinjection(baseline，To)，before PRFand at1，3，5，7and14days afterPRFThe ratswere thensacrificed，and ipsilateralL3LSGs wereremoved fordetermination ofthe expressionof tyrosinehydroxylase(TH)and vesicleglutamate transporter2(VGLUT2)in LSGs(by doubleimmunofluorescent staining)and forexamination ofpathological changes(with alight microscope)The number of neurons expressing VGLUT2was countedRe-suitsCompared withgroup C，the MWTwas significantly decreasedat T16，and thenumber of neuronsexpressing VGLUT2was increased at T6in PDN，PC andPRF groups(P005)Comp盯ed withPDN and万方数据210生堡壁醛堂蓥查垫!堡!旦笠塑鲞箜!塑鱼i!垒!塑i!型!翌!盟!PC groups，the MWTwassignificantlyincreasedat T26，and thenumberofneurons expressingVGLUT2was decreasedatT6ingroupPRF(P167mmolL的大鼠，注射48h时血糖167mmolL为糖尿病大鼠。 于造模前及造模后28d时测定右后足机械缩足反应阈(MWT)，MWT较基础值下降超过50为糖尿病神经痛大鼠。 MWT的测定于腹腔注射前(Tn)、脉冲射频前(T，)、脉冲射频后 1、 3、 5、7和14d(T。 )时，将大鼠置于15era20cmxl5cm的金属笼中适应30min后使用yon Frey纤维丝(Stoeling公司，意大利)垂直刺激其右后肢足底中部，力度以轻微弯曲为准，刺激持续时间约6S。 阳性反应定义为大鼠出现缩足或舔足而不是跳跃性反应；否则为阴性反应。 每个标号测量5次，间隔2rain。 若阴性反应出现3次以上则更换高一级力度的纤维丝否则更换低一级力度的纤维丝，然后按参考文献9中介绍的方法计算MWT。 采用免疫荧光双标法检测酪氨酸羟化酶(TH)和囊泡膜谷氨酸转运体2(VGLUT2)的表达于L时测定MWT后腹腔注射10水合氯醛400mgkg麻醉大鼠用4多聚甲醛固定液灌注心脏，至大鼠出现全身颤抖，肌肉强直肌颤消失。 然后在解剖显微镜下，取术侧k交感神经节，用4多聚甲醛浸泡过夜固定，制成石蜡切片，厚度5m；然后滴加小鼠源抗VGLUT，和兔源抗TH(稀释度1500，Abeam公司，美国)，4oC孵育过夜；然后加入与一抗相应种属的二抗覆盖组织FITC标记的山羊抗小鼠(绿色)和CY3标记的山羊抗兔(红色，稀释度13000，Abcam公司，美国)；避光室温下孵育50min，DAPI复染细胞核封片。 表达VGLUT，神经元数量的确定每只大鼠随机取6张切片，在E600型倒置荧光显微镜(Nikon公司13本)下观察切片并采集图像，每张切片在万方数据史堡盎璧堂盘查垫!生2旦箜!竺鲞筮!塑堡垒垫垒!些堂堂里塑型!翌垫!尘!竺堕!兰400倍高倍镜下随机选取1个视野计数表达VGLUT神经元。 采用SPSS220软件进行分析。 正态分布的计量资料以均数标准差(is)表示，组间比较采用单因素方差分析，P005差异有统计学意义。 结果与C组比较，PDN组、PC组和PRF组Tl-6时MWT降低，T。 时表达VGLUT2神经元数量增加(P005)；与PDN组和PC组比较，PRF组T2-6时MWT升高，T6时表达VGLUT神经元数量减少(P 见表1，2。 表1四组SD大鼠不同时点MWT的比较(g，Z=6，is)分组To TlT2T3T41516C组1254-16128161294-101331212615IZ9Z013418PDN组13O155308a48n9a521185413849n7846128PC组12813490985210850128481185207854118PflF组132414511o丑63n9ab6916日b7221ab7518日b7819ab注与C组比较。 aP005与PDN组和PC组比较，bp005表2四组SD大鼠腰交感神经节表达VGLUT，神经元数量的比较(个，n=6，is)注与C组比较，8P 讨论参照文献4，本研究的方法制备糖尿病神经痛模型，不同时点的MWT测定结果显示，糖尿病神经痛大鼠造模后较造模前及C组同时点的MWT明显降低，提示模型制备成功。 参照预实验结果，本研究对大鼠L椎旁腰交感神经节进行3周期脉冲射频，参数设定温度42、频率2Hz，时间6min。 交感神经节后纤维的神经递质以去甲肾上腺素为主，TH是合成去甲肾上腺素的限速酶，也是去甲肾上腺素能交感神经的标准标志物10|。 在伤害性信息的传递过程中，谷氨酸是外周及中枢神经系统中常见的兴奋性神经递质11|。 VGLUTs负责将谷氨酸纳入和转出囊泡，协助其在突触间的运送，是谷氨酸能神经元的标准标记分子；VGLUTs共有3种亚211型，DRG中主要表达VGLUT，12-13。 本研究结果显示，正常大鼠并不表达VGLUT，糖尿病神经痛大鼠腰交感神经节中则出现VGLUT，的表达，提示去甲肾上腺素能交感神经发生了表型转化。 VGLUT，的表达说明腰交感神经节向突触释放谷氨酸而谷氨酸在神经痛的外周和中枢敏化中发挥重要作用【1。 另外，背根神经节已被证实在神经痛的形成中扮演重要角色14I，并且背根神经节中含有丰富的VGLUT，和谷氨酸受体11】。 通过基因敲除抑制VGLUT，的表达可显著改善神经痛大鼠的痛觉过敏【l51。 因此，腰交感神经节的芽生及表型转化可能与促进背根神经节的兴奋性、导致糖尿病神经痛的痛觉过敏现象有关。 脉冲射频通过发射脉冲在神经组织周围形成高电压，对神经产生长时程抑制16|。 大鼠脉冲射频后3h糖尿病神经痛开始减轻17|。 临床研究表明，脉冲射频缓解糖尿病神经痛的效应可长达3个月E3。 本研究结果显示，脉冲射频治疗后第1天糖尿病神经痛大鼠的痛觉过敏即得到明显改善，并且可持续至术后第14天。 同时，糖尿病神经痛大鼠腰交感神经节内表达VGLUT，的神经元数量明显减少在PC组则未观察到该变化，提示脉冲射频可通过降低腰交感神经节的表型转化，抑制交感感觉神经偶联，从而减轻大鼠糖尿病神经痛。 综上所述，脉冲射频减轻大鼠糖尿病神经痛的机制与抑制腰交感神经节表型转化有关。 利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突参考文献Xu Y，Wang L，He J，et a1Prevalence andcontrol ofdiabetesin ChineseadultsJJAMA，xx，310 (9)948959DOI101001jamaxx168118Abbott CA。 Malik RA，Vail RossER，et a1Prevalenee andcharacteristicsof painful diabetic neuropathyin alargemunitybased diabeticpopulation in the UKJDiabetes Care，xx，34 (10)2220-2224DOI102337dcll1108Naderi NabiB，Sedighinejad A，Haghighi M，et a1Comparison oftranseutaneous electricalnerve stimulationand pulsedra-diofrequency sympatheetomyfor treatingpainfuldiabetieuropathyJAnesth PainMed，xx，5 (5)e29280DOI105812aapm29280熊青明，王汉兵，张锦华，等腰交感神经节射频热凝术对糖尿病神经痛大鼠DRG交感神经芽生和IL一6生成的影响J中华麻醉学杂志，xx，35 (8)979-982DOI103760emajissn02541416xx08019Lee BH，Yoon YW，Chung K，et a1Comparison ofsympathetic sproutingin sensoryganglia inthree animalmodelsofneuro1J1J1J1JJ12345rlLr-rrL-万方数据2126789101112主堡壁竖堂盘查垫!生!旦复塑鲞笙2塑g!i!垒!堕!i!旦!婴!型!Q!尘!堕!pathicpainJExp BrainRes，1998，120432-438Pertin M，Allchome AJ，Beggab AT，et a1Delayed sympathetic dependencein thespared nerveinjury(SNI)model ofneuropathicpainJMol Pain，xx，31 (3)21DOI101186117448069321Bmmovsky PR，Seroogy KB，Lundgren KH，et atSome lurebarsympathetic neurons developa glutamatergicphenotype afterperipheralaxotomy witha noteon VGLUT2-positive perineuronatbasketsJExp Neurol，xx，230 (2)258272DOI101016jexpneur01xx05004王汉兵，王焱林，欧伟明，等糖尿病周围神经病变大鼠疼痛模型的建立J中国疼痛医学杂志，xx，13 (1)4345DOI1039696issn10069852xx01012Chaplan SR，Bach FW，Pogrel JW，et a1Quantitative assessmentoftactile allodyniain therat pawJJ NeurosciMethods，1994，53 (1)55-63Apostolova G，Deehant GDevelopment ofneumtransmitter phenotypes insympathetieuronsJAuton Neurosei，xx，151 (1)3038DOI1010166autneuxx08012Fem6ndezMontoya J，Avendafio C，Negredo PThe Gluta-matergie systemin primarysomatosensory neuronsand itsinvolvement insensory inputdependent plasticityJInt JMol Sci，xx，19 (1)piiE69DOI1033901ijmsl9010069Brumovsky P，Watanabe M，Ht，kfelt TExpression ofthe vesic-ular glutamate咖spone瑙一1and2in aduttmouse dorsalrootganglia and spinal cordand theirregulationby nerveinjuryJNeuroscience，xx，147 (2)469-490DOI1010166neurosciencexx02068Matet MBrumovsky PRVGLUlb andglutamate synthesisfoCUS onDRG neuronsand painJBiomolecules，xx