第五章开题报告与科研设计的实施.doc

第五章开题报告与科研设计的实施 科研课题设计完成后就要付诸实施，即进行科学实验与观察。科学实验与观察的开始称为开题。开题的程序通常是首先进行开题报告，随后进行实验与观察。本章主要介绍研究生学位论文的开题报告和实验与观察的一些原则、方法和注意事项。第一节开题报告 开题报告是科研工作的重要环节，是论证、监督和保证科研工作和学位论文质量的重要环节，通过开题报告也可使更多的人了解、关心和帮助研究生的科研工作，以利于发挥集体的作用，也使研究生更好地了解科研设计和课题进展中应注意处理和解决的问韪，使科研工作进展更顺利。、开题报告的必要性 1避免研究工作的盲目性 研究生在开题报告前应在阅读大量文献的基础上与导师和教研室讨论，进行严格选题和设计，并巳进行预试验做好开题报告的充分准备。研究生做开题报告时，一般需请教研室负责人、本学科及相关学科的专家参加开题报告会，与会者将对该课题进行审核论证和严格把关。对于选题合适、方法得当、措施落实的课题，将批准通过开题。对于选题和设计的先进性、科学性和可行性有问题的课题，要求研究生根据专家们的意见做修改调整，有重大问题者需重新选题、设计和重新做开题报告。 2使科研设计重科学、规范和可行 开题报告会上，与会领导和专家将对研究生的选题目标、主攻方向、实验方法的先进性、科学性和可行性等多方面提出建议和意见研究生从中受到启发，对课题设计进行补充完善，使其更科学规范。 3促进学术交流 开题报告的过程既是对研究生选题的论证过程，又是一个学术交流的过程。与会专家围绕研究生开题报告的内容进行充分的讨论一方面有利于研究生向各位专家学习，博采众长，同时也促进了彼此间的学术交流。 二、开题报告的内容 科研要想达到预期的目的，必须做到研究背景清楚、课题目的明确、研究方案合理。开题报告一般包括“下内容。 1立题背景和依据 主要由研究生对该项研究的历史、现状和发展情况进行分析，着重说明选题的经过，与该课厨相关的国内外研究动态和发展趋势，本课题与前人不同的特点及其先进性。 一45 2课题的目的和巷义 研究生应对所造课题在理论上和实际上的意义、价值及可能达到的水平给予充分的阐述，提出明确的选韪目的。 3研究方案 研究方案是开题报告的重要内容之一，包括研究目标、研究内容、研究方法、技术路线和预期结果等。研究生应对研究方案中的各项内容从理论上和技术可行性方面进行论证t并要说明拟采用研究方法和手段的原创性和先进性，尤其是博士论文开题报告必须阐明本课题研究方案的创新点是什么，预期可能取得怎样的创新成果。 4完成课题需要的备件 开题报告还孺对完成本课题所需要的科研条件(包括设备、经费、实验动物等)是否具备加咀说明。若需合作单位，则要说明合作单位是否落实对研究工作中可能遇到的困难和同题t以及解决的办法和措施也要说明。 5工作进度计划、工作量厦经费预算 略。三、开题报告的一般程序和要求 开题报告在研究生培养过程中占有十分重要的地位，一个好的开题报告就像一篇没有宴验的论文雏形。为_达到开蹶报告应有的作用，必须按一定的程序和要求，认真组织 1开题报告的时间 研究生的开题报告是在学位课程学习结束后，经过查阅文献、选题及完成实验设计后举行，在开题报告前也可先做一些预试验。硕士研究生一般在第三学期进行，博士研究生于第二或第三学期进行。 2开题报告书面材料的准备 开题报告会召开之前，研究生应将开题报告的内容及预试验的初步结果写成书面材料a书面材料要规范，通常按大学研究生院的要求格式进行整理简洁明了，条理清楚，并事先印发给参加开题报告会的主要成员此外，还要将开题报告的内容制作成投影胶片或电子幻灯片，供开题报告会时使用。 3举行开题报告会 硕士研究生开题报告会一般在二级学科范围内进行，博士研究生开题报告会有条件的应在一级学科范围内进行。开题报告会邀请本学科及相关学科的专家、学院(医院、研究所)分管领导组成开题报告审核小组，本专业的教师、研究生参加。该课题在报告会后，再充分听取与会者的意见必要时还需对相关问题进行答辩。 4审核小组对开题报告审核把关 审核小组的专家对开题报告要认真审核，对是否同意通过做出决定，对未达到要求的开题报告可限期修改，重新组织开题报告会。 5填写开题报告表t经审批后存档 开题报告后，研究生应根据与会专家和审核小组的意见t对课题研究方案进行修改、补充和提高然后填写相关表格(各学校或研究单位均有规定的开题报告表格)，按规定的程序审批后存档。一46 在实验与观察阶段如因特殊情况需变动科研题目的基本内容时，要重新进行开题报告并按程序重新进行审批。博士研究生开胚报告未获通过者，应按学校或研究单位的有关规定做出相应处理 开题报告范例：中草药复方对人鼻咽癌细胞系生长的影响殛其机制的研究研究生：X导师；x教授时间：年月x日 一、立题背景和依据 鼻咽癌是我国南方的高发性恶性肿擅，广东地区为世界高发中心广东省四会和香港地区发病宰高达30i0万以上-女性也超过1510万故有“广东癌”之稚据申山大学肿瘤医院统计，每年新发现的鼻咽癌病例占全部来诊恶性肿瘤的25“30“因此。鼻咽癌被列为我国重点防治的恶性肿瘤之一目前，鼻咽癌的主要治疗手段是放射治疗，手术治疗和化学药物治疗仅作为少数病人的辅助治疗手置放射治疗对鼻咽密虽然比较敏感，可“明显提高病的5年生存率，但放射治疗可损伤机体的正常组织，抑制机体的免痤功能，引起明显的甚至强烈的不良反应，治疗后复发率较高尽许近年来放射治疗技术有所改进，但鼻咽癌患者放射治疗后5年生存率只有50彤60蹦t放射治疗对晚期和发生转移的鼻咽癌病人的疗效更差因此，寻找既能抗鼻咽癌又无明显不良反应的新药，单独使用或联合放射治疗以提高病人的生存率和治愈率以及干预鼻咽庙的发生，是鼻晒癌防治研究的必然发展趋势 近年米t随着人们对中药的认识和肿艚研究的不断深，关于中药抗肿瘟的基础试验研究报道越来越多，尤其以单眯中草药的提取成分抗肿瘤研究为多见如萤黄豪、斑蟊的提取物斑】矗紊、茶叶提取物茶多酚、紫杉提取物紫杉醇、栝楼提取物天花粉蛋白、苦参提取物苦参碱、大蒜提取物大蒜油以及金莽麦，淫羊精的提取物等等目前，国内外许多学者对中药复方的抗肿瘤作用进行了轻为深八的实验研究，其基本研究方法是在筛选证实该药方其有抗肿瘟作用的基础上进一步从对肿瘤细胞凋亡、细胞周期阻滞、端粒酶的活性和免疫功自B影响等方面研究药物的抗肿溜机制。 细胞凋亡是受基因酒控的一种主动性细胞死亡过程，它与细胞增殖的动杰平衡维系生长发育、内环境稳定和免痤调节在蠲亡调控方面Bel一2是迄今研究得最为探、广泛的捅亡调控基因之一目前已经发现了至少】5个存在哺乳动物细胞的Bcl-2同源蛋白其中一些属于捅亡抑制蛋白，如Bel-2，BeI-x0，AlBfl一1、BcFw和Mcll等一些则具有橱亡诱导活性如Bax、BdX。Bad、B越Bak、Bid，Hrk等。目前认为，凋亡基因调控失调导致肿痛细胞踊亡抑制是促使肿瘤发生发展的皿要机制之一，四此肿瘤细胞的凋亡及诃控成为抗肿瘤药物作用的靶点。苏勉诚等采用流式细胞术，对中药复方癌宁(由、参、莪术，水蛭等组成)诱导胃癌细胞凋亡机制进行丁研究t拉现癌宁能使TGF日I、Fas和FasL基因裘迭产物台盘显著增高而诱导胃癌细胞凋亡窦志英等实验证明肺一丸(主要成分为姜黄，白_花蛇舌草JL茶、大黄、莪术等)能够抑制肺腺癌细胞的增殖诱导其凋亡，并且存在盘墩依赣性用震华等发现地脾理气方(主荽由党参、白木、获苓等组成)可通过上调Bax基凼噩白的表进而诱导肝癌细胞弼亡车秀容等证明消艏平移合剂(由人参、黄芪、女贞子、补骨脂、莪术、太黄、土茯苓、土贝母、生水蛭、螟蛆等组成_)能通垃下调Bel-2基囚的表达而诱导肝癌细胞凋亡王昌俊等发现巾药复方AC960(fii莪术、白木、苦参，白花蛇舌草等组成)可以通过上州p53、下调Bel一2和p21基目的表选抑制肝癌细胞增殖，促进其掰亡何玉军等发现软坚消肿液(主要由斑蟊、山慈蛄、猪苓，蜈蛆、天冬等组成)可以通过上调Pmyc和p53、下调BcF2基因的裟选而诱导胃癌细胞凋亡国外学者Halieka研究表明PC-SPES(由黄芩、太青叶、三七菊花、灵芝、冬醚草、棕榈子、甘草组成)可减少淋巴瘤和白血病等肿瘤细胞内 一4736“43的Bcl一2蛋白Rafi等发现PC SPES的有效成分之一LA戒少抗凋亡蛋白Bel。2的含量和Bcl2Bax的比值，诱导MCF-7和HL-69肿擅细胞弼亡过些研究表明，中药复方可通过促进细胞捅亡迅到抗肿瘤作用。 细胞周期诟J控机制的核心是一组蛋白戳酶它们各自在细胞周期内特定的时间澈活，通过对相应的蛋白磷酸化，驱使细胞完成细胞周期。这些蛋白激酶的周期特异性或时相性澈活依齄于一类呈细胞周掰性或时相性表达、累积与分解的蛋白质，后者被称为细胞周期索(cydin)，而前者被称为细胞周期依赖性蛋白激酶(CDK)人类细胞主要的CDK有CDKI(CDC2)、CDK2、CDK4，CDK5、CDK6、CDK7(CAK)。人娄细胞周期索有。yclinBl、cyli A。y。linEY linDl、cyellnDZ和cyclinD3。不同的CDK和特定的cyciin结台后控制细胞周期不同阶段的活动CDC2与=ycinBl的结合是M期事件的启动和进行的必要条件，CDK2与cyclinA的结合是G2期事件的启动和进行的必要条件CDK2还负责S期的进行，与eyclinE结合是S期启动的必蔓条件CDK3、CDK,1与cycllne结合，而CDK2、CDK4、CDK5、CDK6与eyclinDl、cyclinD2、ey=IinD3绪台是Gl期运行的必要条件在细胞周蚬调控中至少有4种机制参与CDK的激活。首先，CDK必须与cyelin形成复台物才可获得活性。而这种复合物的形成又依赖于cyelin的生成和降解第二CDK和Cyclln的复合物的激活，需要CDK舟子上第l60位氨基酸附近的苏氨酸残基的磷醴化，过一磷酲化作用是由CAK催他的第三，位于CDK第14位的苏氢酸和l5位的酪氨醢rh CDC25家旗的磷酸酶脱磷酸，是CDK活化的另一机制-最后，CDK的活性还由一纽称为CDK抑制物与CDKcyelln复台物的结合进行调节。哺乳动物拥有两类特异性不同的CDK抑制因子，第一类称为INKi(Inhibitor ofCDK4)目前发现的同类抑制分子包括Pl5、Pl6、P18和Pl 9，过类分子选择性抑制CDK4和CDK6的活性。因此它们阻止Rb的磷陵化将细胞静止于Gj期。第二类抑制分子是一类可以抑制多种CDK活性帕分子包括PZl、P27和P57P21的转录是由抑癌基因p53起始的，P21最重要的功能之一就是参与p53控制的DNA扭伤修复当生长信号通垃信号转导途径和早期应答基因传速到细胞周期田控机制时首先是cyelinD的表达增加澈活CDK4，当生长条件不具备时，pl 6、p15和p27均能抑制其功能活化的CDK4从ATP分子携取大量的磷酸基田，将它们转移到细胞周期机制的主要制南分子RB上。当RB处于低磷酸化状态时，扣留着太赶的转录因子(如E2F)，使它们不能发挥作用，从而阻断了细胞周期的运行但是在CDK4的作用下，RB进入高磷酸化状态，从而失去了其细胞周期的制动功能，RB的失活释盐出大帚的转录困子，它们作用于多十基因，产生多种细胞街抽运行所需的蛋白质(包括cycllnE删yell A等)，驱动着细胞周期的继续进行RB失活后，eyclinE进一步升高与CDK2结台最终激活CDK3产生或激活许多细胞周期相燕碡白启动并进A s斯随后是cycllnA、cyclinBl水平的依次升高和CDK2、CDKI(CDC3)的依捉激活细胞通过G：，M期完成细胞分裂。随着对细胞分裂周期的深了解，AftE清楚了细胞周期呵控的异常与肿瘤发生拉屉的关系，田此干预细胞周期的侧控已成为抗肿痛研究的叉一个靶点雄鹰等研究发现中药复方犀黄丸(由犀黄、麝香、乳香、没药等组成)对人肝船细胞有抑制作用，赴理后24hS期细胞比例增加，G：M期细胞减少处理48h着G，期细胞增多tS期细胞减少李萍萍等实验证明益气活血复方(黄蓖、白术、当归、Jtl芍、红花、莪术、地龙组成)可以阻断人胃癌细胞于GzM期，从而延缓细胞周期进程抑制了细胞的增殖张天娥等以流式细胞术分析中药复方制剂鹤莲克癌临(仙鹤草、半枝莲等为主组成)对小鼠移植性肝癌H22细胞周期影响，发现鹤莲克癌临可使DNA台成期(s)细胞明显减少，而DNA台成前期eG)细胞显著增加表明鹤莲克癌临抗癌细胞学机制是阻赫舾细胞增殖周期同志勇等盐现癌肿宁(由山豆根、莪术、海藻等组成)能引起肝癌细胞S5j阻滞张维彬等发现扶正梧邪方(以黄芪、朴骨脂、灵芝、白花蛇舌草、太黄、莪术、垒竭等组成)能有效地降低小鼠肺癌细胞cyclinDl的表述，彤响细胞周期Gz，s调控点，将细胞周期阻滞干岛G，期。Taolle报道39llml的PC SPES作用48h可引起肿瘤细胞停滞在G z期而停止生长，这种使肿癌细胞停滞在G。期的效果叉引起相应S朝细胞的减少，其作用在MCF-7乳腺癌细胞株表现更为明显 端粒是真接细胞染色体末端的特有结构，由串莲皿复短拍DNA序列与端粒结合蛋白形成的复台体人类染色体端粒DNA序列是抑制5TTAGG3的短片断，由2501 5个重复单位组成太多数普通细胞随着细胞的每次分裂，端粒逐渐缩短，每次采概丢失50300个桉苛酸，它的缩短限制了细胞的增殖能力，故其 48长度技认为是计算细胞分裂j：数的生物钟或有丝分裂钟端牲酶是由RN“和蛋白质组成的抑制拔糖桉蛋白复合体，具有逆转录酶(RT)的活性能以自身的RNA为横扳合成端粒DNA重复序列(TTAGG)，稳定端粒的长度际了胚胎组织、生殖细胞和少数造血干细胞中具有端粒酶活性外，绝大多数休细胞均无端粒酶话性正常悼细胞随若细胞分裂，端粒逐渐缩短至临界长度时就不再保护染色体免受降解或重组，细胞停止分型井最终导致衰老和死亡。目前研究丧明，绝大多数恶性肿出细胞具有端粒酶活性，因而认为肿船的发生与端粒酶的澈括有关，赦抑制肿瘤细胞的端粒酶活性也是抗肿痛研究的新靶点戴恩来研究证明扶正抑癌汤(由黄芪、当归、莪术、墓头回等中药组成)可使肿瘤细胞C,0G期比率升高S期比率下降端粒酶活性被抑制盂志强等发现恤脾理气中药方(由白术、山樯、党参、担壳、茯苓等组成)可使肝癌细胞端粒酶的活性受抑，从而抑制肿瘟细胞的增殖。唐发泊等实验证明中药复方益气解毒颗粒(复方黄连制剂)可u抑制鼻啊上皮癌变细胞端粒酶的激活，从而阻断鼻口口癣的发生、笈展 综上所述，许多研究表明中革药及其复方具有通过当种机制抚肿癌作用而且中草药通常没有放射线和化学药物对机体所产生的不良反应这给人们寻找肿痛防治新途径提供了新的思路然而利用中草药治疗鼻咽癌的研究迄今鲜有报道用其复方制剂_爵疗鼻咽癌的研究更为少见很值得探讨。 率室曾利用人低分化鼻咽癌上皮细跑系(cN E2)对一批中草药进行扰鼻咽癌筛选，发现了一些能抑制鼻口目癌生怔的中草药体扑试验发现一些中草药能显著地抑制人鼻咽麝细胞的DNA合成、细胞活性和细胞浆落形成，抑制率均在60肼以上操鼠伴内实验也证实这些药物能杀伤和抑制鼻咽窟细胞的生长和浸澜，抑痛率接近或超过常埔化学抗癌药5-FU，且对垒身无明显影响率课题在原有工作的基础上，将B经证实具有显著抗鼻咽癌作用的几种中草药组成复方，研究其对鼻咽癌细胞系生长的影响厦其可能的分子机制 二谍题的目的和意义 本课腰在原有工作的基础上，将己经证实具有显著抗鼻咽癌作用的几种中草药组成复方，研究其对彝咽府细胞系生长的影响殛其可能的分子机制，为该药的开发捱供实验依据奉研究对利用中草药防治鼻删癌和开拓鼻咽癌胁治的新途径均有重要的理论和实际意义， 三、研究方案 1研完日标 (1)确定中草药复方体外对彝咽癌细胞生长的抑制作用。 (2)探讨中草药复方抗鼻咽癌细胞生长的某些作用机制 2研竞自喜、方法扣技水路线 (1)中草药复方有效成分的提取按处方比蜘称取各药甩E醇提取法和水提取法提取出有效成分 (2)有效成分分析和质控标准测定用液相和气相色谱分析药物提取物中的主要成分，“主要成分含量或特征性峰值作为药物的质控标准保证本制剂的稳定性，以供下述实验应用a (3)细胞培养与药物处理培养、低、高分化鼻咽癌细胞系CNE-2和CNE-1细胞用多个不同浓度药物提取物与CNE2和CNE-1细胞共培养根据宴验要求于不同时间内收集细胞进行以下实验宴验设空白对豫组和5-FU(氟尿嘧啶)阳性对照组 (4)药物对鼻咽蚵细胞生长的抑制丌j MTT法恻定药物埘鼻咽癌细胞生长的抑制率用MTT法测定药物对鼻咽癌细胞生长曲线的影响l用轼琼脂培养法测定药物对鼻咄癌细胞集蒋形成的抑制率 (5)药物对鼻咽癌细胞弼亡豆其相关调控基因表达的影响 用滤式细胞j去检删细胞罚亡率；用琼脂糖凝胶电泳法观察嗣亡细胞的DNA梯状惫带；用朦位末端标记法检测细胞搁亡的数量及凋亡率用免痤组化法和Westhi t法检测P53疆cl2、Caspas3的表选 (6)药物对鼻嘲癌细胞周期及其相关悄节蛋白的彤响 用流式细胞法检测细胞周期百分比用PCR和wtbl t法检测cyclinDl、cyclinBl，CDC2、PZZ，pl6等的表达 (7)药物x寸舜咽府细胞端粒酶活性韭hTERTmRNA裘这的髟响分别用TRAP。PCR ELISA和RT PCR方法检查端牡酶活性丑hTERT-rmmNA的丧达 3研宽方索的可行性分析 49 本实验研究的中草药复方中的几昧中草药均经实验证实对鼻咀唐细胞生长有显著的抑制作用，组成复方后其抗鼻咽瘤作用很可能更为显著，故本实验要证实该中草药复方抑制鼻删癌细胞生长的作用应是可行的在此基础上t进一步研究其抑制鼻咽癌细胞生长的机制宴验选择的“细胞凋亡”、“细胞周期”和“端粒酪活性”等指标均是与细朐生挺和肿瘤发生发展密切相关的问题，而且也是目前抗肿瘤机制研究的常用内容，因此研究内容和技术路线的设计是合理可行的车实验拟采用的检测细胞生陆的三种方法均是得到公认的经典方法，具有很好的客观性和稳定性拟用于测定细胞凋亡，细胞周期和端拉酶括性的实验方法既有经典的免痤组化法，也有先进的分子生物