间充质干细胞在医学中的应用文献综述.doc

间充质干细胞在医学中的应用文献综述学院：生命科学学院年级：2011姓名：张胜男前言:干细胞是具有增殖分化潜能的一种细胞,人体200多种细胞均起源于一个全能干细胞-受精卵,出生后的机体生存也依赖于不同组织中的干细胞,进行自我更新和损伤修复.追溯到1895年人类第一次临床应用骨髓移植治疗肿瘤疾病,干细胞在临床上的应用已有100多年的历史,间充质干细胞是干细胞家族的重要成员.随着人类技术的发展,人类具备了从成体组织中提取间充质干细胞的能力,并可以在体外进行大量的细胞扩增培养,但是间充质干细胞临床试验研究所面临的基础理论、实验技术、行业法规，法律伦理等问题，使其在真正走向临床应用的道路还很艰难，这条路上还有多少障碍？还有多远？需要的不仅仅是生命科学领域研究人员的努力，也需要相关管理部门同行！正文：1间充质干细胞间充质干细胞英文缩写MSC，存在于多种组织中。1.1间充质干细胞的发现过程间充质干细胞最早在骨髓中发现，随后还发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中。目前, 我们能够从骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、脐带血中分离和制备间充质干细胞，使用得最多的是骨髓来源的间充质干细胞。2006年，我国在胎盘和脐带组织中分离出间充质干细胞，这种胎盘和脐带来源的间充质干细胞有可能成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，并具有更大的应用潜能。鉴于间充质干细胞具有多向分化潜能、能支持造血和促进造血干细胞植入、调节免疫以及分离培养操作简便等特点，正日益受到人们的关注。随着间充质干细胞及其相关技术的日益成熟，临床研究已经在许多国家开展。作为种子细胞, 临床上主要用于治疗机体无法自然修复的组织细胞和器官损伤的多种难治性疾病；作为免疫调节细胞，治疗免疫排斥和自身免疫性疾病。最初的临床研究是1995年由Lazarus等人进行的，他们收集缓解期血液肿瘤患者的自体MSC，在体外扩增培养47周，然后再静脉注射入患者体内，患者被分为3组，分别给予不同剂量的MSC，注射后没有观察到毒副作用，提示MSC用于移植治疗安全可靠。随后自体MSC的临床报道逐渐增多，病种涉及放疗及化疗后造血重建、移植物抗宿主病（GVHD）、心脏系统疾病等，在这些报道中均证明临床经静脉输注安全可靠。然而自体间充质干细胞的应用过程中逐渐暴露了不便之处：例如扩增能力个体差异很大；潜在的肿瘤细胞污染风险；培养需要一定的时间，不能及时适应病情的需要等。这些制约了自体间充质干细胞的使用。间充质干细胞给未来的再生医学带来了新希望, 对间充质干细胞更深入的研究和临床应用必将在不远的将来造福人类。其中，胎盘和脐带来源的间充质干细胞具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等特征，有可能成为最具临床应用前景的多能干细胞。1.2 间充质干细胞的生物学特性间充质干细胞具有其独特的生物学特性a具有强大的增殖与多向分化的潜能，在适宜的体内或体外环境下具有分化为肌细胞，肝细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力。b 具有免疫调节功能，通过细胞间的相互作用及产生细胞因子抑制T细胞的增殖及其免疫反应 ，从而发挥免疫重建的功能。c具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥的特性。通过流式细胞仪检测结果显示，脐血MSCs均一稳定地表达间充质细胞相关的抗原标记：CD29、CD44、CD95、CD105，而不表达与造血有关的表面抗原CD14、CD34、CD40、CD45、HLA-DR。但由于缺少特异性表面标志物，目前还没有直接的方法可鉴定得到MSCs.11.3间充质干细胞的分离培养条件以骨髓间充质干细胞为例，骨髓间充质干细胞是最早发现的一类间充质干细胞。选取人骨髓细胞，经传代培养，实验表明，宜选取4h24h贴壁的有核细胞，培养时向培养基内加入5%10%胎牛血清，可为细胞提供营养，种植密度（48）X104个/ mI的培养条件为最适宜细胞生长；在此条件下，培养扩增的细胞仍具有干细胞多向分化性；其形态呈梭状，具有快速增殖的能力；培养细胞在34d进入对数生长期，随后进入平台期，分裂相细胞明显减少；光镜下细胞呈梭状或类成纤维状，210代的细胞呈均质状；超微结构显示为早期幼稚细胞形态2。1.4 MSC 鉴定由于目前尚缺乏MSCs的特异性标志，对MSCs的特征描述及其分离方法都是以细胞群体的形式进行。许多研究表明，MSCs能表达多种表面抗原，但只具有相对特异性，因此人们一直致力于特异性抗体的研究。1991年Simmons等利用STRO1抗体富集MSCs3；1992年Haynesworth用人骨髓基质细胞免疫小鼠，筛选出3个杂交瘤即SH2、SH3、SH4，其产生的抗体识别人MSCs，而不与骨髓造血细胞系、骨髓基质成纤维细胞反应，也不与成骨细胞和骨细胞反应，因此认为SH2、SH3、SH4这三种抗体是目前鉴定人MSCs的特异性抗体4。直到1999年，Barry与Haynesworth首次利用SH2单克隆抗体，从人MSCs中分离纯化该抗原，通过多肽序列分析和质谱测量法确定为CD105，并作为MSCs的细胞表面标志5。随后SH3、SH4两种抗体所识别的不同抗原决定簇也确定为CD736。另有研究报道，MSCs可特异表达SB10，它与激活的白细胞黏附分子相同，并且在分化过程中消失7。最近，Quirici等发现并利用低亲和力神经生长因子受体抗体，从骨髓中分离出同源性较高的MSCs，并证明具有多分化潜能，已获得成功8。随着对MSCs表面抗原的研究，人们会找到越来越多的抗体对其分离鉴定。2.1 间充质干细胞的研究历程2.1.1间充质干细胞在肿瘤细胞中的研究间充质干细胞具有对创伤及肿瘤组织较为特异的趋向性，M S C s 与 肿瘤微环境之 问存在复杂 的交互作用 。一方面 ，M S C s 可直接作用于肿瘤细胞抑制其生长；也可作为抗 原提呈细胞，激活肿瘤抗原特异性免疫应答；还可作为细胞载体，传递和表达多种抗肿瘤治疗 因子，参与抗肿瘤药物的运输、免疫应答的激活以及新生血管的抑制 。另一方 面，M S C s 强大 的分化和增殖能力促使其参与肿瘤组织的构建 ；通过多种趋化因子作用引起肿瘤细胞表型变化，促进肿瘤恶性行为；M S C s 具有类似“ 免疫豁免 ” 效应 ， 可对各主要类型的免疫细胞产生增殖和活化抑制作用，有助于肿瘤细胞逃逸 ； 表达于 M S C s 表面的多种生长因子和细胞因子可协 同促进肿瘤血管和淋 巴管生成 ， 参与肿瘤侵袭 、 转 移。M S C s 尚具有恶变潜能 ， 在某些条件下可 自 发转化为致瘤干细胞 。M S C s 可 感应 肿瘤 微环 境发 出 的信 号 ， 具有 追踪肿瘤 、 传 递基 因 的作用 ， 在肿 瘤基 因治疗 中展 现 出多方 面优 势 ， 被 认 为 是最 有 发 展 前 景 的肿 瘤 生 物靶 向治疗 工 具之 一 。但 目前其 具 体 机 制 尚不完 全 清 楚 ，且仍 有许 多 问题 尚未 解决9。目前诸多研究将MSC作为诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞的分化、抑制肿瘤血管生成药物的载体，并取得了显著效果。2.1.2 基因治疗 目前关于MSCs的基因治疗有以下方法：目的基因转染MSCs，然后将细胞注入，当细胞归巢到骨髓后就可分泌治疗性蛋白。或者将分泌治疗蛋白的MSCs用一种惰性材料包裹，使蛋白弥散。Krebsbach等人10用因子基因转染人MSCs，注入到SCID小鼠中，至少8 w内可检测到这种蛋白的分泌。因此基因工程中的MSCs，是血友病B和其他由于循环蛋白缺乏而导致的遗传性疾病治疗的有效载体工具。在一定条件下注入MSCs，不仅在骨髓中重建形成细胞群，而且可根据部位特异分化为骨、软骨和神经细胞。研究发现，来自正常供体小鼠的MSCs注入胶原基因突变的小鼠中，受体小鼠的骨、软骨和脑中正常供体细胞替代率可达30%11。因此从严重骨生成缺陷患者的骨髓中分离MSCs，通过培养同源重组替代突变的型胶原基因，然后回输给患者，在期临床治疗阶段，已表现出很好的耐受性和疗效性。采用逆转录病毒载体携带人IL3和绿色荧光蛋白转染人MSCs，转染后细胞在体外仍可分化为骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞，并保持转基因表达，然后将这些细胞经皮下、血管内和腹膜内注入NOD/SCID小鼠。外周血检测显示，全身性的hIL3表达维持在100800 pg/ml，并超过3个月。这项研究说明，人MSCs能有效表达治疗基因，并作为系统性基因治疗的一种细胞运载工具12，13。此外，狒狒、犬科、大鼠、绵羊、山羊、猪和兔MSCs都可以作为一种携带目的基因工具，用于骨髓基质重建和癌相关的细胞毒性治疗14。3.MSC前景展望人类总在幻想自己的身体可以像机器那样拆卸,完美地修复或替代因疾病、战伤、意外事故或遗传因素所造成的组织、肢体或器官的伤残，一直是人类的梦想和难以攻克的医学高峰。利用干细胞工程和现代生物医学技术，有可能使这一难题和梦想成为现实。目前，干细胞研究方兴未艾。MSCs因其具有易于扩增和诱导分化的干细胞特性，加之其来源丰富，采集方便及其移植后的特殊免疫耐受特点，向人们展示了其在组织损伤修复及替代方面的广阔的应用前景。MSCs作为重要的种子细胞，无论从它的来源、分离方法及分化的组织类型上都有其独特的优势，但MSCs的研究面临着几个亟待解决的问题。如MSCs的特异性的标志分子是什么？如何获得更为纯化的MSCs？寻找和鉴定MSCs所特有的细胞表面标志分子，对其分离和培养具有重要意义。鉴于成体组织中存在多种类型的早期细胞，寻找一个更好的鉴定骨髓及远缘组织中的MSCs的方法，是间质发育学研究的范畴，也是MSCs应用研究的当务之急。其次，分化潜能及功能研究将拓展MSCs应用的范围，发现不同来源，不同特性的分化潜能将扩大MSCs治疗疾病的适应证，如MSCs向心肌细胞分化，可应用于急性心肌梗死后的治疗和恢复15向胰岛和肾小管上皮细胞分化，可用于糖尿病和肾小球肾炎的治疗。MSCs作为骨髓基质组分之一，可支持造血并分化为多种间质细胞，单独或HSC共移植，将有助于HSC的植入。再者，干细胞生存的微环境中调控其增殖、更新和分化的关键作用因子及机制也有待进一步研究和挖掘。 但是，相信随着对这些问题的一一解答，不久的将来，人们会以MSCs为突破口，有希望实现让损伤的组织或器官得以“完美”修复或替代的梦想，真正使现代组织工程造福于人类，从移植器官步入制造器官的时代！参考文献:1.脐带血间充质干细胞研究中的若干问题.实用肝脏病杂志2010年12月第13卷第6期JClinHepatol,December2010.Vol.13No.62、骨髓间充质干细胞的分离与培养. 艾国平，粟永萍，闫国和，冉新泽，刘晓宏，罗成基，程天民 （第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所，重庆400038.3、 间 充 质 干 细 胞 与 肿 瘤 ： 抑 制 或 促 进 ? 封 冰 ， 综述 ； 陈龙邦 审阅( 1 南京大学医学院 临床 学院； 2 南京军 区南京总医院 肿瘤 内 科 ， 南京 2 1 0 0 0 24、 Simmons PJ，Torok Storb B.Identification of stromal cell precursors in human bone marrow by a novel monoclonal antibody，STRO 1J.Blood，1991；78(1): 55 62.5、 6 Haynesworth SE，Baber MA，Caplan AL.Cell surface antigens on human marrow derived mesenchymal cells are detected by monoclonal antibodiesJ.Bone,1992;13(1):69 80.6、 7 Barry FP，Boynton RE，Haynesworth S,et al.The monoclonal antibody SH 2，raised against human mesenchymal stem cells，recognizes an epitope on endoglin (CD105)J.Biochem Biophys Res Commun，1999;265(1):134 9.7、 8 Barry FP，Boynton RE，Murphy M,et al.The SH 3 and SH 4 antibodies recognize distinct epitopes on CD73 from human mesenchymal stem cellsJ.Biochem Biophys Res Commun，2001;289(2):519 24.8、 9 Conget PA，Minguell JJ.Phenotypical and functional properties of human bone marrow mesenchymal progenitor cellsJ.J Cell Physiolo，1999；181(1)：67 73.9、 10 Quirici N，Soligo D，Bossolasco P,et al.Isolation of bone marrow mesenchymal stem cells by anti nerve growth factor receptor antibodiesJ.Exp Hematol，2002;30:783 91.10、 Krebsbach PH，Zhang K，Malik AK,et al.Bone marrow stromal cells as a genetic platform for systemic delivery of therapeutic proteins in vivo: human factor modelJ.Gene Med,2003;5(1):11 7.11、Woodbury D，Schwarz EJ，Prockop DJ,et al.Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neuronsJ.J Neurosci