HPLC指纹图谱建立的技术要求ppt课件.ppt

第四节HPLC指纹图谱建立的关键技术要求一 药材样品来源 中间体和注射剂另有规定 应固定品种 药用部位 产地 采收期 产地加工和炮制方法等 供试品的取样参照 中华人民共和国药典 2010年版中规定的中药材取样方法 以保证供试品的代表性和均一性 按1 10取样 二 供试品制备必须确保中药材的主要化学成分在指纹图谱中的体现 多种有效组分应分别提取制备 三 参照物的制备选择适宜的对照品作为参照物 如果没有适宜的对照品 可选择适宜的内标物作为参照物 1 四 测定方法包括测定方法 仪器 试剂 测定条件等必须固定 建议优先考虑色谱方法 对于成分复杂的中药材可以考虑采用多种测定方法 建立多张指纹图谱 注意方法学考察 1 指纹图谱第一 指纹图谱记录时间一般为1小时 但应提供2小时的记录图 第二 TLC法必须提供从原点至溶剂前沿的图谱 第三 对于化学成分复杂 必要时可建立多张指纹图谱 2 共有指纹峰的标定采用色谱方法制定指纹图谱 必须根据参照物的保留时间 计算指纹的相对保留时间 根据10批次的检测结果 标定中药材的共有指纹峰 2 3 共有指纹峰面积的比值 1 以参照物峰面积作为1 要求能出现稳定的峰 计算各共有指纹峰面积与参照物峰面积的比值 参照物可以是对照品也可以是内标物 2 以内标物作为参照物的指纹图谱 则以共有指纹峰中其中一个峰 要求面积相对较大 较为稳定的共有峰 的峰面积作为1 计算其他各共有指纹峰面积的比值 3 各共有峰的面积比值必须相对固定 4 共有峰面积要求 单峰面积占共有峰总面积 20 的共有峰 其差值不得 20 若20 面积 10 共有峰 其差值不得 25 若面积 10 的共有峰 峰面积比值不作要求 但必须标定相对保留时间 未达到基线分离的共有峰 应计算该组峰的总峰面积作为峰面积 同时标定该组各峰的相对保留时间 3 4 非共有峰面积非共有峰总面积不得 总面积的10 5 方法学考察 1 稳定性主要考察供试品的稳定性 取同一供试品 分别在不同时间检测 考察色谱峰的相对保留时间 峰面积的一致性 确定检测时间 2 精密度主要考察仪器的精密度 取同一供试品 连续进样5次以上 考察色谱峰的相对保留时间 峰面积比值的一致性 其峰面积比值的相对标准偏差RSD不得大于3 3 重现性主要考察实验方法的重现性 取同一批号的供试品5份以上 按照供试品的制备和检测方法制备供试品并进行检测 考察色谱峰的相对保留时间 峰面积比值的一致性 其峰面积比值的相对标准偏差RSD不得大于3 4 6 其他注意问题 1 样品定容一般制成样品的标示浓度单位为g ml或mg ml 2 放置供试品溶液应在避光 低温 密闭容器条件下保存 一般不超过两周 溶液不稳定的 一般不超过48小时 3 有效数字相对保留时间和相对峰面积的有效数字要求取小数点后3位 4 留样注意留样的数量不少于实验实际用量的3倍 5 5 参照物复方制剂首选君药的活性成分或指标性成分 尽可能阐明参照物的化学结构及化学名称 也可以选择适当的内标物插入色谱中 6 量化的含义是指在定量的操作条件下 所得到的药材指纹图谱在整体特征上可以半定量的比较 以表达原料药材指纹图谱在 量 方面的总体差异程度 以及半成品 提取物 和成品之间及成品批间指纹图谱在 量 的相对程度 7 相似度软件2004年SFDA 中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件 一般成品指纹图谱相似度计算结果在0 9 1 0之间为符合要求 6 图2福建太子参HPLC指纹图谱 图1福建莲子HPLC指纹图谱 7 第五节研究实例 丹参HPLC指纹图谱构建一 药材来源 GAP基地 与鉴定二 色谱条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 甲醇 0 1 乙酸 5 95 为流动相 检测波长254nm 柱温为室温 流速为1ml min 8 四 供试溶液的制备40目 10批次 各1g 精密称取 蒸馏水提取 趁热过滤 得提取液100ml 加10 盐酸调pH为2 再用乙酸乙酯40ml萃取1次 萃取液浓缩至干 残渣用1ml流动相溶解 作为供试品溶液 HPLC分析前用微孔滤膜过滤 五 测定分别取各批次药材供试品10 l 注入HPLC仪 记录1h色谱 供试品指纹图谱应与质量标准所附的对照指纹图谱有良好的相似性 指纹图谱应有12个特征峰 9 相对保留时间 min 特征峰序号 0 150 1 0 368 2 0 437 3 0 495 4 0 591 5 1 000 S 1 143 6 1 393 7 1 627 8 2 585 9 2 911 10 3 968 11 特征指纹峰面积积分相对比值0 152 30 1 0 72 2 0 191 30 3 0 297 25 4 0 046 5 1 000 S 0 059 6 0 038 7 0