DNA粗提取与提纯ppt课件

第四章遗传的分子基础 4 2DNA的提取和鉴定 1 了解DNA的物理化学性质 理解DNA粗提取以及DNA鉴定的原理 2 尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取及鉴定 3 培养实事求是的科学态度和探索精神 1 DNA粗提取的选材 思路和鉴定原理是什么 2 DNA与蛋白质的性质差异如何 3 破碎动物细胞和植物细胞的方法有何不同 4 根据DNA在NaCl溶液中的溶解度不同如何控制其溶解和析出 5 DNA粗提取和鉴定的步骤是什么 认真阅读教学案 思考以下问题 NaCl 1 DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的 溶液中溶解度不同 利用这一特点 选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解 而使杂质沉淀 或者相反 以达到分离目的 此外 DNA不溶于 溶液 但是细胞中的某些蛋白质则溶于 利用这一原理 可以将DNA与蛋白质进一步的分离 2 蛋白酶能水解 但是对 没有影响 大多数蛋白质不能忍受60 80oC的高温 而DNA在 才会变性 洗涤剂能够瓦解 但对DNA没有影响 3 在 条件下 DNA遇 会被染成 色 因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂 酒精 酒精 蛋白质 DNA 80oC以上 细胞膜 沸水浴 二苯胺 蓝 实验思路 4 2DNA的提取和鉴定 DNA从哪提取 怎样将DNA与细胞中的其他物质分离 怎样鉴定我们提取的DNA 实验原理 1 DNA在NaCl溶液中的溶解度 是随着NaCl的浓度的变化而改变的 当NaCl的物质的量浓度为0 14mol L时 DNA的溶解度最低 利用这一原理 可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出 2 DNA不溶于酒精溶液 但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液 利用这一原理 可以进一步提取出含杂质较少的DNA 3 酸性条件下 DNA遇二苯胺 沸水浴 会染成蓝色 因此 二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂 2mol L 0 015mol L 实验材料 1 鸡血细胞液 5 10ml 2 体积分数为95 的冷酒精溶液 实验前置于冰箱内冷却24h 3 蒸馏水 4 质量浓度为0 g ml的柠檬酸钠溶液 抗凝剂 5 物质的量浓度分别为2mol L和0 015mol L的NaCl溶液 6 二苯胺试剂 实验过程 课前制备 鸡血细胞液 b 鸡血细胞极易吸水胀破 而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心 对设备要求较高 操作繁琐 历时较长 3 选择鸡血做实验材料的原因 a 鸡血细胞核的DNA含量丰富 材料易得 1 实验材料的选取 2 选材 新鲜的猪血新鲜的鸡血 原则上只要含DNA的生物材料都可以 但是选取DNA含量相对较高的生物组织 成功率更大 哺乳动物成熟红细胞无细胞核 DNA含量极少不易提取 4 制备鸡血细胞液过程 取质量浓度为0 1g ml的柠檬酸纳溶液 抗凝剂 100ml 置于500ml烧杯中 注入新鲜的鸡血 约180ml 同时用玻璃棒搅拌 使血液与柠檬酸纳溶液充分混合 以免凝血 将烧杯中的血液置于冰箱内 精置一天 使血细胞自行沉淀 也可以将血液倒入离心管内 用1000r min 转每分 的离心机离心2min 血细胞沉淀于离心管底部 实验时 用吸管除去离心管上部的澄清液 就可以得到鸡血细胞液 5 柠檬酸钠作用 防止血液凝固 6 实验时 为什么用吸管除去离心管上部的澄清液 血液分为两部分 一部分是血浆 一部分是血细胞 离心后上清液是血浆 不含有血细胞 除去它就可以得到鸡血细胞液 DNA容易被玻璃容器吸附 所以最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液 7 注意事项 步骤1 提取鸡血细胞的细胞核物质 将制备好的鸡血细胞液5mL 10mL 注入到50mL烧杯中 向烧杯中加入蒸馏水20mL 同时用玻璃棒充分搅拌5min 使血细胞加速破裂 然后 用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500mL 取其滤液 讨论 1 为什么要加入蒸馏水 加入蒸馏水后细胞会有什么变化 2 用玻璃棒搅拌有什么意义 3 滤去的是什么物质 得到的是什么 分析 答 让细胞内浓度大于周围溶液的浓度 细胞会吸水以至胀破 1 为什么要加入蒸馏水 加入蒸馏水后细胞会有什么变化 2 用玻璃棒搅拌有什么意义 答 用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂 注意应沿一个方向快速搅拌 但也不能太快太猛 防止打碎DNA 3 滤去的是什么物质 得到的是什么 答 过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质 得到的是与蛋白质等物质结合在一起的DNA 步骤2 溶解细胞核内的DNA 将氯化钠的物质的量浓度为2mol L的溶液40mL加入到滤液中 并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min 使其混合均匀 这时DNA在溶液中呈溶解状态 步骤3 析出含DNA的粘稠物 沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水 同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌 这时烧杯中有丝状物出现 注意观察丝状物呈什么颜色 继续加入蒸馏水 溶液中出现的粘稠物会越来越多 当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水 这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0 14mol L 讨论 加入蒸馏水的目的 降低NaCl溶液浓度到使DNA溶解度最低点 使DNA从NaCl溶液中析出 实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水 并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌 以利于DNA分子的附着和缠绕 注意事项 步骤4 滤取含DNA的粘稠物 用放有多层纱布的漏斗 过滤步骤3中的溶液至500mL的烧杯中 含DNA的粘稠物被留在纱布上 步骤5 将DNA的粘稠物再溶解 取1个50mL烧杯 向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为2mol L的溶液20mL 用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中 用玻璃择不停地搅拌 使粘稠物尽多地溶解于溶液中 步骤6 过滤含有DNA的氯化钠溶液 取1个100mL烧杯 用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液 取其滤液 DNA溶于滤液中 步骤7 提取含杂质较少的DNA 在上述滤过的溶液中 加入冷却的 酒精的体积分数为95 的溶液50mL 使用冷却的酒精 对DNA的凝集效果较佳 并用玻璃棒搅拌 溶液中会出现含杂质较少的丝状物 用玻璃棒将丝状物卷起 并用滤纸吸取上面的水分 这种丝状物的主要成分就是DNA 因为DNA不溶于冷酒精 而其他物质可以溶解在酒精中 使含杂质较少的DNA丝状物可以析出 悬浮于溶液中 讨论 2 观察丝状物呈什么颜色 白色 1 为什么要加50mL的冷酒精 步骤8 DNA的鉴定 取两支20mL的试管 各加入氯化钠的物质的量浓度为0 015mol L的溶液5mL 将丝状物放入其中一支试管中 用玻璃棒搅拌 使丝状物溶解 然后 向两支试管中各加入4mlL的二苯胺试剂 混合均匀后 将试管置于沸水中加热5min 待试管冷却后 观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化 讨论 答 有丝状物的试管变成蓝色 另一试管还是原来颜色 2 这一鉴定结果说明什么问题 1 比较两个试管中溶液的颜色有什么不同 答 提取出的丝状物是DNA 3 DNA的直径约为20 10 10m 实验中出现的丝状物的粗细是否表示1个DNA分子直径的大小 答 DNA分子直径只有2nm 丝状物是多个DNA子聚在一起形成的 答 整个实验共 第1次 步骤1 细胞吸水胀破第2次 步骤3 使DNA黏稠物析出 此实验过程中有几次使用蒸馏水 几次过滤 几次析出 几次搅拌 分别在哪一步 实验总结 两次蒸馏水 三次过滤 两次析出 六次搅拌 两次蒸馏水 过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有关 第二次要用其滤出的黏稠物有关 所以要使用多层纱布 第一次和第三次均要用其滤液 使用的纱布为1 2层 三次过滤 第1次 步骤1 DNA存在于滤液里第2次 步骤4 DNA被留在纱布上第3次 步骤6 DNA存在于滤液里 两次析出 第1次 步骤3 用0 14mol L的NaCI溶液 含杂质多 第2次 步骤7 用冷却的95 的酒精 六次搅拌 其中除第8步外 其余均要朝一个方向搅拌 在第三 五步搅动还要轻缓 玻璃棒不要直插烧杯底部 这样才能保证得到完整的DNA 第1 2 3 5 7步 思维拓展 如果以植物 菜花 洋葱 为实验材料 如何进行DNA的粗提取和鉴定 植物细胞需要加入一定的洗涤剂和食盐 实例 提取洋葱DNA时 在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐 进行充分的搅拌和研磨 过滤后收集研磨液 讨论 加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么 答 洗涤剂是一些离子去污剂 能溶解细胞膜 有利于DNA的释放 食盐的主要成分是NaCl 有利于DNA的溶解 B 1 在蛋白质和DNA的混合液中 要想得到较纯的DNA 可采用的方法有 向混合液中加入足量的蒸馏水 向混合液中加入DNA水解酶 向混合液中加入冷的95 的酒精 向混合液中加入蛋白质酶A B C D 2 在 DNA的粗提取和鉴定 实验中有三次过滤 1 过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液 2 过滤含黏稠物的0 14mol LNaCI液