【毕业学位论文】含黄素氧化酶3 基因多态性对盐酸伊托必利药代动力学的影响-（临床药理学）

分类号 密级 U D C 编号 中 南 大 学 士 学 位 论 文 论文题目 含黄素氧化酶 3 基因多态性对盐酸伊托必利药代动力学的影响 学科专业 药 理 学（临床药理学） 研究生 姓名 陈 豪 指导教师 周 宏 灏 教授 I 分类号 密级 硕士学位论文 含黄素氧化酶 3 基因多态性对盐酸伊托必利药代动力学的影响 者姓名： 陈 豪 学科专业： 临床药理学 学院 （系、 所） ： 临床药理研究所 指导教师： 周宏灏 论文答辩日期 答辩委员会主席 中 南 大 学 2008 年 5月 要 目的： 测定三种常见 变等位基因在中国汉族健康人群中的发生频率， 同时在健康男性体内研究 因多态性对伊托必利药代动力学的影响。 研究方法： 采用聚合酶链式反应 方法对 158K、 行基因型分析。挑选出 158K、 为野生型纯合子（ *W） 个体 6 名 、 158K、 锁突变型纯合子（ *L） 个体 6 名 、 147S 突变型纯合子个体（ *S ） 6 人共 18 人，进行临床试验。试验当日早上空腹口服 50托必利，分别于 0、 1、 2、 3、 4、 6、8、 10、 12、 14、 24 小时采 5周静脉血，采血后半小时内进行离心和分离血浆 ,运用 测定血浆中伊托必利及其代谢产物浓度， 分析比较不同基因型间伊托必利及其代谢产物各药代动力学参数的差异。 结果： 对 274 名健康志愿者进行了 147S、 得 147S 基因频率为 308G 基因频率为 等位基因频率符合衡。 因是连锁的。比较不同基因型间各药代动力学参数，伊托必利和伊托必利 组间存在差异且均具有统计学意义。 *S 和 *L 组伊托必利 *W 和 （ P ， 伊托必利 * P S/*S 组和 *L 组伊托必利 *W 组高 和 （ P ，伊托必利 *W 组低 P *W 组口服清除率（ ） 、血浆 率（ 尿液代谢率（ 显著高于 *S 和*L 组，具有统计学差别。 *S 组和 *L 组其他药代动力学参数与 *W 组未见统计学差异 （除 *S ）。 结论： 158K、 为中国人群中的常见突 ， 因是连锁的， 与韩国人群研究报道一致。 147S、 锁基因多态性对伊托必利在健康者体内的药代动力学均有着显著的影响。 关键词： 托必利，基因多态性，血药浓度 I To 158K、an of on of 158K、 147S to in *W） , 158K & *L） , 147S *S） . a 0mg a 、 1、 2、 3、 4、 6、 8、10 、 12 、 14 4 of 274 147S、 308G 158K 308G of a of L/*L *S in W/*W T (55, s 15167GA (5 5， h 21443AG (5 5D， d 谱分析 采用液相色谱串联质谱法检测伊托必利和伊托必利 谱条件 色谱柱为 18 柱（ 150 5 m） ；流动相为乙腈 : 10酸胺水溶液（含 酸） （ 60:40， v/v） ，流速为 0.2 mL温 40，自动进样瓶温15。 谱条件 采用 行离子方式扫描监测； 电压： V；源温度： 100；去溶剂气体温度： 350 ；锥孔气体流速： 50 L/h；去溶剂气体流速： 450 L/h。采用多反应监测 (式进行定量分析 ,伊托必利、伊托必利 m / z m / z m / z 碰撞能量分别为 20 30 20 硕士学位论文 第二章 材料和方法 品预处理方法 取血浆或尿液 200 L 置于 2内，依次加入 50 L 内标（ 100 ng、 100 L 100酸胺，旋涡振荡 10 s，再加入乙酸乙酯 1涡振荡 2 分钟， 13000 r0 上清 500 L， 40氮吹仪吹干， 200 L 流动相溶解， 10 L 进样（尿液 2 L 进样） 。 托必利及其 精密称取 托必利对照品，置于 10量瓶，加 10醇 水 11 溶解并稀释至刻度，颠倒及震荡摇匀，即得到 mg/存液，置于 4冰箱保存。将储备液用空白血浆或尿液按梯度稀释成 置于 箱保存。 精密称取 托必利 照品，置于 10量瓶，加10醇 水 11 溶解并稀释至刻度，颠倒及震荡摇匀，即得到 500 g/存液，置于 4冰箱保存。 将储备液用空白血浆或尿液按梯度稀释成 ng/置于 箱保存。 必利内标溶液配制 精密称取 必利对照品，置于 10量瓶，加 10醇 水 11 溶解并稀释至刻度，颠倒及震荡摇匀，即得到 mg/存液，置于 4冰箱保存。将储备液用甲醇 水 11 按梯度稀释成 100 ng/置于 箱保存。 准曲线制备 取空白血浆 16060L， 分别加入 200制成相当于血浆浓度为 125、 250、 500伊托必利 “样品预处理方法”处理后进行伊托必利浓度为横坐标 (X)，以伊托必利和 Y)，得出直线回归方程。 代动力学分析 药代动力学参数中，血浆峰浓度（ 达峰时间（ 实测值直接得出。将对 硕士学位论文 第二章 材料和方法 10数化（自然对数）的浓度 得直线的斜率即清除速率常数，清除半衰期按公式 =计算，采用梯形法计算药时曲线下面积， 其中可测浓度 无穷远处的尾端残余校正面积由 估算， 0-)= (4h 浓度 )。口服清除率按公式 (L/h)=口服剂量 /算。 率（ 代谢率 (算方法： 中 累积排出量 / 托必利的累积排出量。 计分析 运用 件进行数据分析。所有数据均以平均值 标准差表示。三组基因型（ W/*W、 *S/*S、 *L/*L）组间均数比较符合方差齐性检验时采用单因素方差分析(方差不齐时采用 检验。 P T (同基因型测序图。箭头所指处表示基因位置。 A 图：野生型； 合突变型 表 3个 W/T) W M P 57 92 25 76 85 13 .5 1/3 , D. ( ) 谱方法学结果 属性 图 3 A 图为舒必利 征离子图谱； B 图为伊托必利 征离子图谱； C 图为伊托必利 征离子图谱。取受试者空白血浆或尿液 0.2 “样品预处理 ”项下操作，进样 10 L（尿液 2L），得空白血浆样品或空白尿液样品质谱色谱图 （ 图 3。 将一定浓度的伊托必利、 伊托必利 “样品处理 ”项下操作得空白血浆样品或空白尿液样品质谱色谱图（ 图 3受试者的血浆样品或尿液样品加内标质谱色谱图 (图 3伊托必利 右（ 图 3结果表明血浆或尿液样品经处理后，内源性物质不干扰伊托必利和内标的测定。峰形良好，无杂质峰干扰测定，本法专属性较高。 硕士学位论文 第三章 实验结果 16图 3 A 图为舒必利 征离子图谱 征离子图谱 C 图为伊托必利 m/5 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400% 0 100 % 0 100 0 100 342 1 (4376 1 (7659 6 (59 C B 硕士学位论文 第三章 实验结果 17图 3白血浆不加标准品和内标的总离子流图 图 3白血浆不加标准品和内标的总离子流图 5 S+02n,17 7 S+02n,12 1 3 S+02n,15 2 S+03n,1 S+04n,1 S+05n,1 硕士学位论文 第三章 实验结果 18图 3浆样品和内标的总离子流图 3白尿液不加标准品和内标的总离子流图 65 S+ 02n,11 71 S+ 02n,12 47 S+ 02n,12 S+03n,1x2)1 S+04n,1 0 S+06n,1 硕士学位论文 第三章 实验结果 1 S+04n,13 S+03n,10 S+ 06n,1白尿液加标准品和内标的总离子流 图 3液样品和内标的总离子流 0 S+ 04n,11 S+04n,10 S+ 06n,1 硕士学位论文 第三章 实验结果 性范围及最小检出浓度 用空白血浆或尿液将标准储备液稀释成不同浓 度的混合液，按“样品预处理方法” ，采用内标法得到血浆中检测标准曲线：伊托必利线性范围为 线回归方程为 Y ，决定系数（相关系数 r 的平方）为 图 3权重为1/x，最小检出浓度为 ng/托必利 性范围为 直线回归方程为 Y ，决定系数（相关系数 r 的平方）为 图 3，权重为 1/x，最小检出浓度为 ng/中检测标准曲线：伊托必利线性范围为 线回归方程为 Y ，决定系数（相关系数 r 的平方）为 图 3，权重为 1/x，最小检出浓度为 ng/托必利 直线回归方程为 Y ， 决定系数 （相关系数 r 的平方）为 图 3，权重为 1/x，最小检出浓度为 ng/ r = r2 = x + ), ( )1/x, 00 200 300 400 500 浆伊托必利测定标准曲线图 硕士学位论文 第三章 实验结果 21r = r2 = x + ), ( )1/x, 0 100 150 200 250 300 350 400 450 浆伊托必利 定标准曲线图 r = r2 = x + ), ( )1/x, 00 200 300 400 500 600液伊托必利测定标准曲线 硕士学位论文 第三章 实验结果 22r = r2 = x + ), ( )1/x, 0 100 150 200 250 300 350 400 450 液伊托必利 收率 按照上述 “线性范围 ”项下的方法，配制伊托必利浓度分别为 ngng “血浆样品预处理 ”项下操作，测得血浆中伊托必利的峰面积，将所得峰面积与相应同等浓度的伊托必利标准品溶液直接进样后得到峰面积相比，得出方法的提取回收率（ 表 3 表 3浆中伊托必利的回收率（ n=5） 加入浓度 （ （ of （ n=5） 加入浓度 （ （ of ， ngng “血浆样品处理 ”项下操作，测定日内、日间变异。结果见表 3内、日间 表 3浆中伊托必利的精密度（ n=5） 日内（ 日间（ 浓度 （ /（ （ （ n=5） 日内（ 日间（ 浓度 （ /（ （ ， ngng 件下保存，于第 5， 10， 15 别取此血浆 0.2 “血浆样品处理 ”项下操作。计算伊托必利的含量与制备当日的测定值比较。 硕士学位论文 第三章 实验结果 24试验结果表明，峰面积基本不变，各供试样品稳定性较好。 代动力学分析 临床试验完成顺利，未见受试者述说任何身体不适。 图 3*W、 *S/*S 和 *L/* *L/*应的伊托必利图 3B）；伊托必利和伊托必利 *L/*应的伊托必利 图 3B）。表为不同基因型伊托必利和伊托必利 托必利和伊托必利 组间存在差异且均具有统计学意义（除 * 表 3 * P=和 110%（ P ， 伊托必利 * P （ 图 3 * P 伊托必利 * P 图 3 *别比 * P 伊托必利 别比 * P 图 3 * *S *别比* P *别比 * 其他药代动力学参数未见统计学差异。 表 3 为伊托必利口服清除率， *S 和 *L/*L 组比 *W 清除率分别低 图 3；伊托必利 托必利 度 /伊托必利浓度）为伊托必利转化成伊托必利 指标，*S 和 *L/*L 组 *W 个体分别低 图 3； *S 与 *L/*L 组与 *W 组比较 图 33。 硕士学位论文 第三章 实验结果 25h)0 5 10 15 20ng/100200300400500600W/*S/*L/*h)0 5 10 15 20ng/50100150200W/*S/*L/*同基因型受试者伊托必利和伊托必利 平均血浆浓度时间曲线（ D） A： 伊托必利 B：伊托必利 A 硕士学位论文 第三章 实验结果 26表 3同 因型受试者伊托必利及其 (h) ng/h) hng/(hng/*W/*W(1) S/*S(2) L/*L(3) 71 02a*W/*W(1) S/*S(2) L/*L(3) 04 11 18标准差表示 浓度； 峰时间； ：终末半衰期； 4： 0 24小时的药时曲线下面积； ： 0的药时曲线下面积a： P G 增加16 减少16 增加16 增加16 减少16 减少1672GT 少1611166GA 少1611177CA 少1615089GC 少13, 1715167GA 少1818281GA 少 21443AG 少13, 1921599TC 加13, 1724642AG 少 其中， 余的突变均为少见突变，频率大都 1%。一些著名数据库 , 类基因组突变数据库 ,人类突变数据库 ,内体外的研究表明 ,这些突变可以影响蛋白的折叠和断开 片层结构15。 3. 证实了常见突变位点 257M,四种不同人群之间的相对频率展现出显著的统计学差异14，见表 2。 常见 因突变发生频率的种族差异 硕士学位论文 第七章 综述 42基因高加索人（ n=179） 非洲人 (n=90) 亚洲人 (n=66) 西班牙人 (n=85) 齐性检验 （ p）158K 257M 08G 的研究同样证实了与非洲裔美国人相比，在高加索人群 多态位点具有更高的频率13。比较中国汉族人群和非洲裔美国人群常见多态位点的基因和基因型频率发现 在两族人群中存在显著的差异 , 在汉族人群 ,主要的基因频率 在非洲裔美国人群 ,主要的基因频率 0