北京大学医学部攻读硕-博士学位研究生课题研究计划书.doc

北京大学医学部攻读博硕士学位研究生课题研究计划书 研 究 生 李玉霞 学 号 1411210743 年 级 2014级 院 （部） 北京大学/香港科技大学医学中心专 业 医学生物化学与分子生物学 导 师 方征宇 课题研究开始日期: 2015年 03 月 09 日 北京大学研究生院医学部分院培养办公室制表说 明一、 本计划书由研究生本人在本学科内作过开题报告后填写，一式三份；经院(部)主管部门批准后一份留教研室，一份留院（部）主管部门，一份送研究生院医学部分院培养办公室备案。二、 计划批准后不得随意更改。如有特殊情况确需变更者，需填写变更报告，逐级审批。研究课题名称黑色素瘤顺铂获得性耐药相关microRNA筛选及其功能的研究研究课题的目的、理论与实际意义、国内外研究情况简介课题的目的：1、构建黑色素瘤顺铂获得性耐药细胞株，与其原始株进行microRNA的高通量筛选比较，找到耐药相关的microRNA，作为潜在的治疗靶点。2、分析耐药相关microRNA通过调控哪些基因的表达来影响黑色素瘤细胞的耐药性，阐明其分子机制。理论与实际意义：近几十年来,恶性黑色素瘤在全球的发病率迅猛升高,成为所有恶性肿瘤中发病率增长最快的肿瘤,年增长率几乎达到3-5%。其中白色人种发病率明显高于其他人种, ,我国和日本等亚洲国家的黑色素瘤发病率与欧美国家相比相对较低,但近年来其发病率呈迅猛上升趋势。恶性黑色素瘤治疗方法主要有手术治疗、放射治疗、化学药物治疗及生物免疫治疗等。化疗在恶性黑色素瘤治疗中仍占有重要地位。目前化疗药物主要有顺铂、长春新碱和组蛋白去乙酰化酶抑制剂等。顺铂是现在临床上多种化疗方案中的主要药物之一,通过与癌细胞的脱氧核糖核酸发生交叉联结,诱导肿瘤细胞的凋亡而起抗癌作用,属细胞增殖周期非特异性药物，但是多种恶性黑色素瘤常会对顺铂产生天然或获得性耐药,因而提高顺铂的抗肿瘤作用,解决顺铂耐药在恶性黑色素瘤的化疗中有着重要的实际意义。 顺铂耐药机制,主要包括细胞内药物积累的减少，DNA损伤修复作用增强,凋亡通路的变化以及一些microRNA的异常表达。由于microRNA的表达易于调控，如果能找到黑色素瘤中与耐药相关的microRNA，可建立以此为靶点的干预手段。国内外研究情况简介：在其他肿瘤细胞中，已经有人验证出一些microRNA的变化会影响肿瘤对顺铂的敏感性，而目前关于microRNA在黑色素瘤顺铂获得性耐药机制中的作用研究较少。主要研究内容研究内容1：构建黑色素瘤顺铂耐药株选取了七种黑色素瘤细胞系M7、M21 、SK-MEL-103、M29 、A375、M8 、SK-MEL-19依次检测对顺铂的敏感性,在对顺铂比较耐受的细胞株中选取了A375、M8、SK-MEL-19构建了顺铂耐药株并将A375、M8做了microRNA的表达谱芯片。研究内容2：黑色素瘤顺铂耐药株与原始株microRNA芯片分析及验证通过分析microRNA表达谱芯片，对黑色素瘤顺铂耐药株中异常表达的microRNA用荧光定量PCR进行验证，确定要研究的microRNA。研究内容3: 顺铂耐药相关基因反向筛选预测microRNA查阅文献，汇总顺铂耐药相关基因，在黑色素瘤顺铂耐药株与原始株中用荧光定量PCR验证，根据耐药基因的变化反向预测microRNA。研究内容4：microRNA对黑色素瘤顺铂耐药的影响及其分子机制 根据microRNA靶基因预测数据库找到靶基因，进一步研究microRNA对顺铂黑色素瘤耐药的影响及其分子机制。主要研究方法1、 构建黑色素瘤顺铂耐药株MTS法检测药物敏感性以及顺铂耐药株的耐药指数。2、 黑色素瘤顺铂耐药株与原始株microRNA芯片分析及验证Real-time PCR验证microRNA芯片结果。3、 顺铂耐药相关基因反向筛选预测microRNAReal-time PCR验证顺铂耐药相关基因，microRNA靶基因预测数据库分析结果。4、 microRNA对黑色素瘤顺铂耐药的影响及其分子机制Dual-Luciferase Reporter验证microRNA与靶基因的关系，慢病毒构建靶基因相关稳转株，Western Blotting验证靶基因相关蛋白的变化。研究进度及具体安排2015年3月-2015年8月进度：黑色素瘤顺铂耐药株构建2015年9月-2015年12月进度：microRNA芯片分析及验证,顺铂耐药相关基因的筛选2016年1月-2016年10月安排：microRNA对黑色素瘤顺铂耐药的影响及其分子机制的研究预期结果1、 通过microRNA芯片找到与黑色素瘤顺铂耐药相关的microRNA2、 通过microRNA靶基因预测数据库找到microRNA的靶基因3、 microRNA的靶基因通过调节细胞内的相关蛋白对顺铂耐药有作用，通过敲除或者过表达该基因可以逆转黑色素瘤顺铂获得性耐药。完成课题的条件协助导师具体指导的人员配备周游博士后、细胞培养技术员黎满慧、试剂采购技术员董小林主要仪器设备情况Bio-Rad PCR仪、Bio-Rad Rael-time PCR仪、Bio-Rad 酶标仪、Bio-Rad 蛋白电泳仪、Eppendorf 离心机、Stuart涡旋振荡器、Wise Therm 干浴锅、超净台、显微镜、-20冰箱等实验动物情况没有动物实验药物试剂等来源情况DMEM(GIBCO)、PBS(Invitrogen)、Tyrisin(GIBCO)、MTS(Promega)、Lipofection2000(Promega)、RT kit(Promega)、Real-time supermix (Promega