人工蛹虫草子实体中核苷类成分的超声提取工艺研究

1摘要蛹虫草属于真菌类物质，人工蛹虫草子实体具有很高的药用价值和营养价值，尤其是人工蛹虫草子实体中含有的核苷类物质，它的应用十分广泛并有极高的应用价值和开发潜力。本实验以人工蛹虫草子实体为原料，以核苷类物质的提取率为考察指标，比较了超声波提取法、热回流提取法和微波提取法对核苷类物质的提取效果，并对提取溶剂进行了考察。实验结果表明：以水为提取溶剂，超声波提取法效果最佳。正交试验法优化超声波提取的最佳工艺条件为：液料比为40:1、提取温度80、超声功率为100W、提取时间40min、提取次数3次。在最优提取条件下，采用HPLC法测定人工蛹虫草子实体腺苷和虫草素的含量分别为0.197%和0.148%。关键词：蛹虫草子实体；腺苷；虫草素；超声波提取；HPLC2AbstractAsthefungussubstance，theculturedmyceliaofCordycepsMilitarishasahighmedicalandnutritionalvalue,especiallyitsnucleosidehasbeenwidelyused.Ithasahighapplicationvalueanddevelopmentpotential.TheexperimentregardstheculturedmyceliaofCordycepsMilitarisastheresearchmaterial，theextractionrateofnucleosideasindicators.ToinvestigatethemethodappliedintheextractionofnucleosideinCordycepsmilitarismyceliaWater-extractionmethod，ultrasonicwaveextractionandmicrowaveextractionmethodwereappliedintheextractionofnucleosideAndselectedthebestextractionsolvent.Theexperimentshowsthatthemethodofmicrowaveextractionisthebest,andthebestextractionsolventiswater.TheexperimentusethemethodofHPLCtodeterminationofcordycepsmilitarisartificiallyfruitbodyandthecontentofChinesecaterpillarfungusadenosinemeal.Orthogonaldesignwasbeusedtoassesstheprocessconditionswhichinfluencingtheextractionandseparation,andfinaloptimizedconditionsforextractingnucleosidewasestablished,thengetthebestconditionis:Liquidmaterialthanis40:1、thetemperatureis80、thetimesis3、thetimeis40min.Keywords：Cordyceps；Adenosine；Cordycepin；HPLC；Ultrasonicextraction；3目录摘要.1Abstract.2第一章前言.5第二章文献综述.62.1蛹虫草子实体.62.1.1蛹虫草子实体的营养成分分析.62.1.2蛹虫草子实体的功能作用.62.1.3蛹虫草子实体的应用.72.1.4蛹虫草子实体的国内外研究现状.102.2蛹虫草子实体中的活性成分核苷类物质.102.2.1核苷类物质的结构与理化性质.102.2.2核苷类物质的功能.112.2.3核苷类物质的应用.112.3核苷类物质的提取方法概述.122.3.1超声波提取法.122.3.2微波提取法.122.3.3热回流提取法.122.3.4溶剂萃取法.132.3.5超临界CO2萃取法.132.3.6膜分离法.132.3.7柱层析分离法.142.3.8无机盐复合沉淀法.142.4核苷类物质的含量测定方法概述.142.4.1高效液相色谱分离鉴定技术.142.4.2薄层色谱分析技术.152.4.3紫外分光光度法.152.4.4红外光谱分析法.152.4.5其他方法.162.5本论文的研究内容及研究意义.16第三章试验部分.173.1材料与设备.173.1.1原材料.173.1.2主要试剂.1743.1.3主要仪器.173.2试验方法.173.2.1核苷类物质的提取工艺.173.2.2提取方法的选择.183.2.3提取溶剂的选择.193.2.4核苷类物质的检测.193.2.5超声法提取核苷类物质的工艺优化.193.3结论与讨论.213.3.1标准曲线的绘制.213.3.2提取方法的确定.223.3.3提取溶剂的选择.223.3.4单因素试验结果.223.3.5正交试验优化结果.253.3.6最优提取条件下的提取率.26第四章结论与展望.274.1结论.274.2展望.27致谢.28参考文献.295第一章前言近年来，随着人民生活水平的不断提高，人们日益注重保健品及保健药物的使用。人工蛹虫草子实体以其独特的营养保健功能，引起了人们广泛的重视。蛹虫草又称北冬虫夏草，北虫草，主要分布于我国东北三省和河北地区，是一种具有较高营养价值的真菌，在食品、保健品、药品方面都有着广泛的应用1。目前，随着大量西医药理试验和临床研究的深入，蛹虫草的诸多功效已经被证实。素有“百药之王”的蛹虫草，是一个天然的化合物宝库，价值珍贵，它含有的虫草素、虫草多糖和虫草酸等具有多种药用和保健功能，不仅对癌症、糖尿病、肝病、肺病、肾病、过敏性疾病、心脑血管病等有良好的治疗效果，更重要的是，它能双向调节免疫、强壮补虚与平衡调理，保持健康，减轻和预防疾病的发生，尤其以对癌症的预防效果、促进病后的恢复等方面具有确切的功效2。本论文的课题研究主要包括两方面内容：第一部分是人工蛹虫草子实体中核苷类物质的提取方法的比较研究；第二部分是超声法提取人工蛹虫草子实体中核苷类物质的工艺优化。6第二章文献综述2.1蛹虫草子实体2.1.1蛹虫草子实体的营养成分分析蛹虫草-形态特征子座单生或数个一起从寄生蛹体的头部或节部长出，颜色为橘黄或橘红色，全长2-8cm，蛹体颜色为紫色，长约1.5-2cm。蛹虫草的菌丝是一种子囊菌，其无性型为蛹草拟青霉。其菌体成熟后可形成子囊孢子（繁殖单位），孢子散发后随风传播，孢子落在适宜的虫体上，便开始萌发形成菌丝体。菌丝体一面不断地发育，另外一方面开始向虫体内蔓延，于是蛹虫就会被真菌感染，分解蛹体内的组织，以蛹体内的营养作为其生长发育的物质和能量来源，最后将蛹体内部完全分解。一般当蛹虫草的菌丝把蛹体内的各种组织和器官分解完毕后，菌丝体发育也进入了一个新的阶段。菌丝体由营养生长开始转为生殖生长，最后扭结后从蛹体空壳的头部、胸部、近尾部等处伸出，形成橘黄色或橘红色的顶部略膨大的呈棒状的子座（子实体）3。蛹虫草子实体及发酵液中含有虫草素（3脱氧腺昔）、腺嘌呤、脱氧胸苷、尿嘧啶、腺苷、次黄嘌呤、鸟苷、尿苷、N6-甲基腺苷、N6-（乙酰胺甲酰）氧乙基、O5-乙酰基虫草素等核苷类化合物，为蛹虫草子实体的主要活性成分之一4。其中虫草素（cordycepin）是1951年Cumingham等人从蛹虫草的培养物中分离到的一种腺苷类活性物质5。虫草素含量是野生冬虫夏草的几十倍，而传统冬虫夏草仅含微量虫草素，（冬虫夏草含虫草素0.001%，蛹虫草含虫草素0.0053%）；蛹虫草中的虫草酸含量是4.11%，略低于传统冬虫夏草含量6.49%；SOD（超氧化歧化酶）酶活为184.4u/mL，比活为42.4u/mg，而传统的冬虫夏草低于它,酶活为149.3u/mL,比活为10.3u/mg；虫草多糖为12.8mg/100g,而传统的冬虫夏草为7mg/100g；此外，人工栽培的蛹虫草中的蛋白质，氨基酸，维生素和微量元素的含量均接近或者超过传统冬虫夏草的含量6。72.1.2蛹虫草子实体的功能作用2.1.2.1虫草素的功效人工培养的蛹虫草子实体及其发酵液中含有多种药用成分，虫草素是一种抗菌素，具有抗菌、抗病毒、干扰人体RNA及DNA合成，明显抑制多种肿瘤生长的作用，虫草多糖类对网状内皮系统及巨噬细胞有明显的激活作用，能促进淋巴细胞转化，是一种非特异性免疫增强及调节剂，可激活机体的免疫活性细胞，特别是淋巴细胞及淋巴因子、单核巨噬细胞系统和NK细胞等，从而攻击靶细胞发挥抗肿瘤作用，同时具有抗衰老、抗氧化、抗凝血、降血糖、降血脂等作用，能提高免疫力，改善肝功能延缓衰老等。2.1.2.2虫草酸的功效虫草酸是止咳平喘的药效成分之一，有扩张气管，镇静，抗多种细菌作用。2.1.2.3SOD的功效SOD酶抗类风湿，红斑狼疮，皮肌炎，抗癌，防辐射，并具有抗衰老和美容的作用。2.1.2.4虫草多糖的功效虫草多糖能提高人体免疫力，起到扶正固本的作用，对老年慢支气管炎，肺炎，心脏病有缓解作用，能提高肝脏的解毒能力，起到护肝作用7。2.1.2.5硒的功效此外，北冬虫夏草还含有丰富的硒（Se），这种微量元素已被大家公认是人体必须的微量元素，是谷胱甘肽过氧化酶的活性中心，以硒半胱氨酸的形式连接在酶蛋白的肽链上，保护细胞膜的稳定性和正常的通透性，并刺激免疫球蛋白和抗体的产生，增强机体免疫和抗氧化能力。同时，大量的科学实践证明硒可明显地抑制癌细胞的生长。据全国中草药汇编记载：“蛹虫草的子实体和虫体可作为冬虫夏草入药”8。在本草从新上记载了蛹虫草的保健作用，虫草具有保肺益肾，止血化瘀，补精益髓等功效9。现在中医主要用于调补身体，治疗头昏失眠，夜间盗汗，喷血，呼吸道抵抗力差，肾功能衰竭等疾病10。2.1.3蛹虫草子实体的应用2.1.3.1食品方面蛹虫草蛋白质食跫高达40.688%，比天然冬虫夏草25.437的含黾高出l5.25%，比人工裁培的香精高出21.728%，此富含蛋白质的大豆粉高0.87%。蛹虫草蛋白质由19种氨基酸构成，必需氨基酸种类齐全而且数量充足，比例适宜，占氨基8酸总量的35.47%，氨基酸总量比香菇增加30.5%11。已测出蛹虫草中含有17种，其中硒、镁、钾、磷含量明显高于天然的冬虫夏草。蛹虫草中古有维生素A、B、C和尼克酸，且含量丰富。在“食物成分表”中，任何一种食物都无可比拟。如维生素B含量是猪肝的13倍，Vn是人乳的4338倍，其它含量也很丰富。专家们认为，虫草(干)维生索营养价值之高可谓惊人的发现。1990年5月1991年4月，浇阳市卫生防疫站按照食品毒理学评价程序对蛹虫草进行了毒性安全性评价，检验结果：“认为该虫草作为食品系列对人体健康是安全可靠的.”综上所述，蛹虫草是一种对人体健康极好的营养源，且无毒副作用12。蛹虫草气味芳香，很有吸引力。蛹虫草酒增加了原白酒的营养，经中科院沈阳应用生态研究所检验，其蛋白质含量为0.137g100mL；氨基酸总量为318.65mgL，微量元素Cu、ZnFe、Mn、Mg、K的含量都明显高于对照品13。简易服用方法：用法一：简易的服用方法是将干燥的北虫草子实体用开水浸泡饮用。使用量：如为保健用，每人每日用量为2-5克。治疗用，每人日服量15克。可分3-4次饮用，每次将干品置于杯中，倒入开水浸泡1-2分钟，液体出现桔黄色即可饮用。第一次喝完可再次加入开水浸泡，至水色变淡为止，最后可将杯中子实体放入口中嚼咽入肚，效果更佳。用法二：可泡酒饮用：蛹虫草5g，可泡酒(750mL)一瓶。用法三：炖鸡汤或煲鸡汤。北虫草怎样使用更有效：虫草味甘平、齿颊留香，最适合炖（煲）汤食用。滋补品讲究食疗周期。如想增强抗病能力、预防感冒、靓泽皮肤，连服一个月为一个周期，通常每月10次为佳。而患病者则宜采取食疗调节器法或遵医嘱，若症状减功能或消失，则改食保健调法，以达固本培元，标本兼治之效14。2.1.3.2医药方面现代的临床研究表明北虫草、蛹虫草具有多方面的功效，它主要应用在慢性肾功能衰竭、免疫功能低下、急慢性肝炎、化疗的辅助保护、心脏功能不全、心率不齐、肺炎、肺结核、哮喘、脑血栓、脑萎缩、肿瘤辅助治疗、糖尿病等。其中大多数是辅助治疗作用，总体来说虫草应用于保健和预防比治疗效果要好15。冬虫夏草能保护和提高巨噬细胞,提高吞噬百分率。使肝、脾吞噬系数值显著提高，并保护T淋巴细胞免受损伤，增强细胞免疫功能，增强肝脏功能，促进新陈代谢。食用虫草者免疫能力提高的达到80%。徐曦等报道，北虫草、蛹虫草能提高免疫及造血功能，使其外周血及脾脏淋巴细胞增殖，并使脾细胞产生白细胞介素2能力增强，使天然杀伤细胞活性增高。并促进造血细胞增殖，对免疫或造血功能低下、癌症等疾病有显著的辅助治疗作用16。北虫草、蛹虫草能保肺益肾、止血化痰，明显地舒张支气管平滑肌，增强肾上腺素等一系列作用因而对改善肺功能、老年慢性支气管炎、哮喘、肺气肿、肺心病9等疾病能起到减轻症状，延长复发时间等作用。肖琅等对30例肺源性心脏病呼吸衰竭患者在综合治疗的基础上辅以冬虫夏草治疗，结果发现应用冬虫夏草后除苯丙氨酸外的人体必需氨基酸均增高。因此认为北虫草、蛹虫草的虫草素能通过改变血浆氨基酸，使支链氨基酸、芳香族氨基酸比值上升，从而对肺心病、呼吸衰竭发挥辅助治疗作用。郑星宇报道，单味北虫草、蛹虫草防治老年反复呼吸道感染疾病有良好效果17。身体经过运动或劳累后会在肌肉组织内堆积大量乳酸和其他代谢产物，而北虫草、蛹虫草能加速血液循环，将其迅速清除。同时，运动后体内自由基增加，其终产物丙二醛（MDA）有细胞毒性是造成疲劳的主要原因。服用虫草之后，丙二醛（MDA）极显著的下降，这表明北虫草、蛹虫草能显著地抑制脂质过氧化，减少自由基产生，保持细胞膜的正常功能。因而具有极好的抗缺氧、抗疲劳、提高运动能力的作用18。北虫草、蛹虫草能显著降血液中的低甘油三脂、胆固醇和脂蛋白含量，从而抵抗血栓形成，抗心律失常并有效降血压。实验表明虫草治疗心率失常和高血压总有效率达70%以上，降低胆固醇总有效率达76.2%。国内龚晓健等报道用人工虫草菌丝体石油醚提取物抗心律失常作用较强，可明显对抗乌头碱所致的心律失常，延长心律失常的诱发时间，降低心律失常持续时间及严重程度。对氯化钡所致心律失常也有一定的对抗作用，能降低心律失常严重程度。还有报道用虫草水提液具有良好的抗触发性心律失常的作用19。蛹虫草能增高浆皮质醇含量，提高目标组织中肾上腺、胆固醇含量。增加肾上腺素的分泌，因而具有较好肾壮阳效果。食用虫草者肾功能好转率占60-70%。尚德静等试验表明，用北虫草、蛹虫草发酵液及北虫草、蛹虫草制剂均能改善阳虚症状并使阳虚病人的体重、自主活动次数增加，使阴茎勃起潜伏期缩短，证明北虫草、蛹虫草具有益气壮阳的功效。北虫草、蛹虫草能抑制癌细胞裂变，阻延癌细胞扩散，显著提高体内T细胞、巨噬细胞的吞噬能力，使它们与癌细胞战斗的能力大大增强。实验表明食用虫草后一个月肿瘤抑制率达62%以上。国内外研究表明虫草对体外培养的人鼻咽W癌细胞（KB细胞）及人宫颈癌细胞（Hela细胞）等均有抑制作用。徐仁和等研究发现冬虫夏草醇提液体内给药能明显增强小鼠体内NK活性及抑制肺癌克隆的形成，并能部分拮抗Cy对小鼠NK活性的抑制作用20。在目前医学界所公认的七大类抗衰老活性成分中，虫草就涵盖了五大类，分别是多糖、氨基酸、多肽（蛋白质）、核酸和维生素（另外两者是黄酮和皂甙类）。冬虫夏草能减轻由于衰老引起的中枢儿茶酚胺水平下降以及由此造成的对机体生化过程的损害，并清除人体有害的自由基，从而起到延缓衰老、健康长寿的作用。因此北虫草、蛹虫草特别适合于中、老年人的日常保健和病后康复。李连德等采用从虫10草深层发酵产物中提取的多糖进行抗衰老试验，结果表明：不同来源的虫草多糖对果蝇寿命均有不同程度的延长作用，从而证明虫草多糖有延缓衰老的作用。北虫草、蛹虫草中的活性物质虫草酸、虫草素对葡萄球菌、鼻疽杆菌、猪出血败血症杆菌、枯草杆菌、乌型结核杆菌等都有明显抗拒和抑制作用。给慢性乙肝病人及乙肝病毒携带者食用后，恢复正常的占31.5%,症状明显得到改善的占40.6%，总有效率达78.56%。国内曾有多家报道用冬虫夏草治疗乙型肝炎的成功案例。如刘玉凤等临床观察报道冬虫夏草多糖脂质体有明显改善肝脏功能、抑制乙肝病毒的作用。北虫草、蛹虫草能明显减少小鼠自发活动时间，延长戊巴比妥睡眠时间，表现出明显的镇静作用。梁永录等研究结果表明，冬虫夏草及人工菌丝体均有镇静作用21。2.1.3.3日化方面北虫草、蛹虫草能扩张血管、增加皮肤表层的血液循环，起到美容、护肤作用22。2.1.4蛹虫草子实体的国内外研究现状我国是第一个对蛹虫草进行商业化栽培生产的国家,1986年吉林省蚕科研究所以家蚕和柞蚕为寄主培养蛹虫草,获得与天然蛹虫草相一致的子实体,开启了我国蛹虫草人工栽培的新纪元23。蛹虫草作为药(食)用菌已被广泛接受,市场需求在不断扩大,加强其药用和保健价值的开发是未来深入研究的重要内容。蛹虫草常被作为传统名贵中药冬虫夏草的代用品来开发,虽然取得了不少成果,但其自身特殊的活性成分及药理作用仍有待深入研究。如虫草素的代谢途径及主要调控因素还未完全弄清,阻碍了生物合成研究的发展。加强蛹虫草各种药理机制及有效成分的研究,可为蛹虫草由传统民间用药转为现代型的保健品或药品提供科学依据,同时进行蛹虫草优良菌种的选育和高产技术的研究,提高蛹虫草的产量和有效成分含量等都是今后蛹虫草研究重要内容24。2.2蛹虫草子实体中的活性成分核苷类物质虫草素是蛹虫草中主要的核苷类物质，它具有抗菌活性，对核多聚腺苷酸聚合酶有很强的抑制作用。在DNA转录mRNA过程中使mRNA成熟障碍，抑制癌细胞的生长。并有降血糖的作用。蛹虫草中核苷类物质的提取与开发利用使蛹虫草的医药保健价值得到更进一步的探究25。112.2.1核苷类物质的结构与理化性质尿嘧啶:C9H12N2O6,白色粉末；鸟嘌呤:C10H13N5O5,白色粉末；腺嘌呤:C10H13N5O4,白色粉末；胸腺嘧啶:C5H6N2O2,无色针晶；胞嘧啶：C10H12N3O5,白色粉末；虫草素：C10H13N5O3，针状或片状结晶26。图2-2蛹虫草中的各种核苷类物质2.2.2核苷类物质的功能虫草素是一种抗菌素，具有抗菌、抗病毒、干扰人体RNA及DNA合成，明显抑制多种肿瘤生长的作用，虫草多糖类对网状内皮系统及巨噬细胞有明显的激活作用，能促进淋巴细胞转化，是一种非特异性免疫增强及调节剂，可激活机体的免疫12活性细胞，特别是淋巴细胞及淋巴因子、单核巨噬细胞系统和NK细胞等，从而攻击靶细胞发挥抗肿瘤作用，同时具有抗衰老、抗氧化、抗凝血、降血糖、降血脂等作用，能提高免疫力，改善肝功能延缓衰老等27。虫草素是一种具有抗菌活性的核苷类物质，对核多聚腺苷酸聚合酶有很强的抑制作用。在DNA转录mRNA过程中使mRNA成熟障碍，抑制癌细胞的生长。并且有降血糖作用。虫草多糖是一种高度分枝的半乳甘露聚糖，它能促进淋巴细胞转化，提高血清lgG抗体含量和机体的免疫功能，增强机体自身抗癌抑癌的能力28。2.2.3核苷类物质的应用蛹虫草子实体中核苷类物质中含量较多，同时应用也较广泛的是虫草素，基于虫草素的诸多如抗肿瘤，提高机体免疫力等功能，人们已把虫草素添加到一些药品和保健食品中，从而制得了有抗肿瘤，抗衰老，提高机体免疫力等众多功效的药物和保健食品；此外虫草素以外的核苷类物质也被较广泛的用在药物、保健食品以及试验品领域。可以说，现如今，随着人们对蛹虫草子实体中的核苷类物质功效的进一步开发，蛹虫草定能更好的造福人类。2.3核苷类物质的提取方法概述2.3.1超声波提取法超声波提取法是基于超声波特殊的物理性质。主要是通过压电换能器所产生的快速的机械振动波以达到减少样品和目标萃取物基体之间的作用力以实现固液的萃取分离。超声波提取法的原理29是：（1）加速介质质点运动：在声波频率高于20KHz的超声波连续介质（如水）中传播时，根据惠更斯波动原理，传播的波阵面上会引起介质质点运动，使其获得巨大的加速度和动能。经计算质点的加速度可以达到重力加速度的2000倍以上。介质质点可以将超声波能量作用于样品内部的质点上从而使其获得巨大的加速度和动能，也使样品中的活性成分游离到水中。（2）空化作用：利用超声波可以在液体介质中传播过程中产生特殊的“空化效应”，内部压力可达到上千个大气压的微气穴迅速产生，并且不断“爆破”使在微观上产生强大的冲击波作用，从而使成分物质“轰击”逸出，加速浸出提取。（3）超声波的振动匀化可使样品介质内各点所受到的作用一致，也可使整个样品提取更为均匀。2.3.2微波提取法微波提取法30是利用微波能来提高提取效率的一种辅助提取技术。物料中极分子与微波电磁场之间的在微波场中的相互作用使物料可以吸收微波能量，之间的差13异使基本物质中的某些区域被选择性加热，并从基体体系中分离出来，从而进入微波吸收能力相对较弱的提取剂中。微波具有强烈的热效应可使酶灭活，因此可适用于多糖、苷类等极易被酶解的成分、具有热稳定性的物质物料、有良好的吸水性、不适于热不稳定性物质和富含淀粉树胶的物质。2.3.3热回流提取法热回流提取法31是以甲醇、乙醇等易挥发的有机溶剂为提取溶剂，对浸出液加热蒸馏，挥发性溶剂馏出后经冷凝后重新回到浸出器中继续浸提，并循环进行，直至有效成分完全浸提。热回流法是将样品放入冷凝系统的浸取器内，然后用溶剂浸没样品的表面，浸泡一定时间后再加热浸提，蒸发的溶剂经冷凝后直接回流到浸取器内，规定时间后可将回流液滤出，再添加新溶剂继续回流数次，合并各次回流的浸出液，再馏出溶剂，即可得浸出的浓缩液待用。2.3.4溶剂萃取法核苷溶剂的萃取32是根据混合核苷中不同组分在不同溶剂中溶解性的差异产生的分离而进行的，主要包括单一溶剂法与混合溶剂法。单一溶剂法主要溶剂为低碳醇，资料报道的常用低碳醇有C1-C3醇，生产中最为常见的为乙醇。在乙醇中PC的溶解度远远大于PE和PI，在醇溶的部分PC的含量较高，而在醇的不溶部分则含较高的PE，所以通过乙醇萃取可分别得到含有PE和PC的产品。M.Sosada等人33研究了用乙醇做溶剂提取油菜磷脂，使PC含量由28%提升到58%，并制作了最优条件的实验。重松康彦34以丙醇为溶剂分离核苷中的PE和PC，其原理为在丙醇中PE和PC通过不同温度下溶解度的不同而进行分离，通过该方法可使核苷中的PC从77.2%提升到97.6%。单一溶剂法中，为了得到具有较高PC含量的核苷，有学者曾在醇中加入无机盐以提升对PC的选择性。L.Kwan35利用ZnCl2对核苷进行分离提纯，将1mg核苷（含PC约为45%）溶于90%的乙醇中，加入4.5gZnC12，可生成淡黄色核苷复盐沉淀，通过离心分离、沉淀。于氮气下用250mL冰冻丙酮分解，可得到36.7ug核苷含量99.6%的核苷。2.3.5超临界CO2萃取法超临界CO2流体萃取36作为一种新型的分离技术，是利用流体(溶剂)在临界点附近与植物油中的核苷有异常相平衡行为和传递性能，且它对核苷的溶解能力随压力和温度的改变而在相当宽的范围内变动从而达到磷脂分离的一种技术37。使用超临界CO2法来对核苷进行分离是近年来的研究热点，但由于核苷在超临界CO2中溶解度非常小，必须使用夹带剂。宋启煌38等人以粉末核苷为原料，在20MPa和50的条件下，使用乙醇做夹带剂可成功的提取出富含PC的核苷，乙醇和核苷的比为5014(V/W)，而且随温度的升高PC的含量增加显著。藤原新吾等人以粉末核苷为原料，CO2-乙醇混合溶剂做提取剂，可得到含PC为85%的产品。2.3.6膜分离法膜分离法是先用乙烷等有机溶剂将核苷溶解，形成核苷胶囊后再通过一定孔径大小的半透膜，根据核苷的不同组分中分子量大小不同可以加以分离。该技术目前正用于高纯产品的提取工艺，如使溶于乙烷-异丙醇混合液的核苷溶液可通过聚丙烯半透膜，可使核苷的浓度由25%提升到51%39。由于现在膜功能尚不能完全的分离分子量相近的组分，所以还需要开发特定的功能膜才能应用到工业生产中。2.3.7柱层析分离法柱色谱分离技术柱层析是以吸附剂为固定相，移动相中的溶质在通过固定相时，由于它们的吸附和解吸能力的不同，从而达到分离的目的40。常用的吸附剂为氧化铝、硅胶、硅藻土等，洗脱液常选用低碳醇、氯仿等几种溶剂的混合物。最其中最具有代表性的过程是：首先从油脚中提取出核苷的粗品，然后再经过柱层析法可分离纯化获得纯度较高的大豆核苷。国外研究报道采用硅胶作填料，并用低碳醇作洗脱剂对大豆粗核苷提纯，可得到含90%以上的核苷。2.3.8无机盐复合沉淀法核苷能与金属离子发生配合反应，形成配合物，生成沉淀41。利用此种性质，可以把核苷类物质从有机溶剂中提取出来，除去脂肪、蛋白质等杂质，再用适当的溶剂分离出核苷类物质和无机盐杂质，从而大大提高核苷纯度。CaCl2，MgCl2，ZnCl2均可与核苷发生配合反应形成复盐，但CaCl2和MgCl2提取核苷较低，沉淀不明显。据资料报道，用ZnCl2乙醇纯化核苷的具体方法42是:将0.1g粗核苷溶于1L90%的乙醇中，再加入4.5gZnCl2，便可生成核苷ZnCl2复盐沉淀，离心分离此沉淀物，在氮气保护下，用25mL冰丙酮与沉淀物混合，搅拌1h，可得到含量高达99.5%的核苷。2.4核苷类物质的含量测定方法概述2.4.1高效液相色谱分离鉴定技术高效液相色谱(HPLC)是分离和鉴定核苷的一种非常有用而且精细的设备45。核苷可通过这种方法与其它核苷进行分离。在HPLC中，固定相，溶剂被泵加压到21.128.0MPa之间，有时接近2832MPa。核苷可在专用色谱柱中被吸收，通过溶剂系统按不同流速被分离出核苷混合物中的各组分。（1）实验原理15精密称取烘干的人工蛹虫草子实体和其培养基粉末(过0.125mm筛)各0.2g,加入提取溶剂各20mL,分别采用超声波震荡、加热回流和水浴温浸的方法对样品进行提取,过滤,滤液进行冷冻干燥后用水定容至5mL,最后分别过0.22m滤膜,经HPLC柱进行分析,根据其峰面积计算不同提取方法的虫草素和腺苷含量,进而筛选出最优的提取方式46。（2）样品提取条件的优化核苷为水溶性物质,所以对虫草素和腺苷提取一般选用水、甲醇和乙醇等溶剂,方法一般选用超声、加热回流和水浴温浸等。关于不同方法对虫草素和腺苷提取效率的影响各文献报道不一。本实验通过比较不同乙醇浓度超声、加热回流和水浴温浸对虫草素和腺苷提取效率的影响,料液质量比均为140，40超声40min,加热回流和水浴温浸的温度分别控制在75和60，时间均为5h。结果表明，无论是在子实体还是在培养基中虫草素和腺苷的提取效率随着乙醇浓度的增大均有明显的下降趋势,可能是因为它们水溶性极好,随着乙醇浓度的提高它们的溶解度有所降低,并且对腺苷提取率的影响明显大于其对虫草素的影响,这与文献报道一致,并且腺苷提取率超声加热回流水浴温浸,而虫草素提取率在子实体中是超声加热回流水浴温浸,在培养基中是超声加热回流水浴温浸,这可能与子实体中其他复杂的活性物质或是温度影响有关,但真正的原因还需进一步探讨。综上可知,腺苷最优提取条件是超声水提,提取子实体中的虫草素时水加热回流效果最好,在提取培养基中的虫草素时水超声提取率最高.但是在提取子实体中的虫草素时,水加热回流虽然优于水超声提取,可差别不大,并且水加热回流程序复杂,耗时较长,而水超声提取方便快捷,提取率也较高,另外考虑到腺苷的热稳定性较差,所以本实验最终选择超声提取法提取人工蛹虫草子实体和其固体培养基中的虫草素和腺苷47。（3）供试品中虫草素和腺苷含量测定通过供试品HPLC洗脱峰的保留时间与标样比较，以及洗脱峰面积与虫草素和腺苷含量之间的线性回归方程关系即可得出供试品中虫草素和腺苷含量48。2.4.2薄层色谱分析技术薄层色谱法简称TLC法，是几年来发展起来的重要的分析方法，具有设备快速、简单、展开剂和吸附剂选样灵活、适于小样分析和分析结果直观等优点49。TLC法已经在分析核苷类产品方面得到较好的应用。资料报道:D.Medn和H.Weigel用两步单向二维TLC展开法分离了PC、PE、PI、PA，这种方法采用了两种不同的溶剂展开系统在同一方向对混合核苷类物质进行展开，故可以用此法定性和定量地分析核苷脂类混合物种各组分。另据报道50的TLC方法:在距底部1.0cm处点样，然后将薄板放到用展开剂饱和的展开槽中，溶剂的高度从底部0.5cm处展开至顶端12cm处取出薄板，在通风槽中干燥后即可显色，若用荧光硅胶板展开亦可在紫外灯下16观察，硅胶板一般要50min左右。2.4.3紫外分光光度法紫外分光光度法是基于物质对紫外光(波长范围100400nm)具有选择吸收的分析方法51。将所提出来的的核苷溶于无水乙醇，浓度为0.1%，用紫外分光光度计测定吸收光谱，标准核苷的紫外最高吸收峰在215nm。根据最大吸收波长和吸收峰的形状，可进行核苷定性分析、分子结构推测及组分定量测定等。2.4.4红外光谱分析法将纯化的样品与核苷纯品进行红外光谱测定，就可以定性分析核苷类物质含量。因为此种分析方法设备较为简单、操作容易、分析灵敏度高，这也是一种使用的分析方法52。2.4.5其他方法目前，国外还有的单位采用核磁共振法53分析核苷的产品，但其仪器设备较为昂贵，不适合在国内使用。还有使用光密度扫描法和电磁场法对产品定量分析54。2.5本论文的研究内容及研究意义在本论文中探讨和研究了一些用来提取、分离并测定人工蛹虫草子实体中的核苷类物质，通过正交试验法确定了实验所需的最佳条件，从而对实验进行了优化，并且确定了蛹虫草子实体中各种核苷类物质的含量。实验中得到的最优方法及一些数据对以后的关于人工蛹虫草子实体核苷类物质的提取工艺的研究提供了许多参考，有利于相关方面的研究。鉴于蛹虫草极高的营养价值及药用价值，相信在不久地未来，有关蛹虫草子实体的研究定会突飞猛进。17第三章试验部分3.1材料与设备3.1.1原材料人工蛹虫草子实体，市售。3.1.2主要试剂（1）甲醇，色谱纯，北京试剂厂；（2）乙醇，分析纯，北京试剂厂；（3）水，超级纯，北京试剂厂；（4）石油醚，分析纯，北京试剂厂；（5）HCl，分析纯，北京试剂厂；（6）氨水，分析纯，北京试剂厂；（7）乙醚，分析纯，北京试剂厂；其他试剂均为分析纯，水为三次蒸馏水。3.1.3主要仪器（1）600E岛津色谱仪，日本岛津；（2）SPD紫外检测器，上海天美科学仪器公司；（3）Empower色谱数据管理系统，天津市泰斯特仪器有限公司；（4）KQ-600超声波清洗器，北京德天佑科技有限公司；（5）WR-2001型溶剂过滤器，梅特勒-托利多仪器有限公司；（6）0.22um滤膜，梅特勒-托利多仪器有限公司；（7）25uL微量进样器，北京化工厂；（8）移液管，北京化工厂；（9）1050ul移液枪，北京化工厂；（10）FD-1C型冷冻干燥机，北京德天佑科技有限公司；（11）活性炭，北京化工厂。3.2试验方法3.2.1核苷类物质的提取工艺人工蛹虫草中核苷类物质的提取工艺流程如图3-1所示。18图3-1人工蛹虫草子实体中核苷类物质提取工艺3.2.2提取方法的选择分别称取人工蛹虫草子实体粉末3份，每份1g，分别加入20mL蒸馏水，比较超声波提取法、微波提取法和热回流提取法三种提取方法对核苷类物质的提取效果，提取工艺参数见表3-1，核苷类物质的提取率见公式1。（公式1）%0mnvc）核苷类物质提取率（式中：m为原料蛹虫草子实体粉末质量，g；c为核苷类物质的浓度，mol/L；v为核苷类物质溶液体积，L；n为核苷类物质的摩尔质量，g/mol。19表3-1几种提取方法工艺参数3.2.3提取溶剂的选择分别用甲醇、乙醇和水作为提取溶剂，比较各提取溶剂对核苷类物质提取效果的影响。分别称取蛹虫草粉末1g，加入甲醇、乙醇、水各20mL，用超声波提取40min，提取温度60，抽滤浓缩后，冷冻干燥得到粗品。采用高效液相色谱法测定其含量，计算提取率，平行操作三次，以选择较适宜的提取溶剂。3.2.4核苷类物质的检测核苷类物质含量的测定采用GB/T5009.87-2003中华人民共和国药典第一法中的高效液相色谱法55。3.2.4.1标准曲线的建立（1）对照品溶液制备精