蛹虫草菌丝体液体培养条件的优化

摘要蛹虫草，也称北冬虫夏草，具有补虚损、益精气、保肺、益肾、止血化痰、滋补强壮等功效，是我国的名贵中草药材。本论文采用沈阳微生物研究所提供的蛹虫草优质菌种，通过斜面培养、液体培养等过程，获得优质的蛹虫草菌丝体，并以菌丝体重量为指标，对培养温度、初始pH值、培养箱转速、最佳碳源、最佳氮源、最佳无机盐等液体培养条件进行单因素分析，通过正交试验法确立了蛹虫草菌丝体的最佳培养基配方。实验结果表明，蛹虫草菌丝体培养最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源是蛋白胨，最佳无机盐是KH2PO4和MgSO4；最佳培养基配方是葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，KH2PO41.0g/L，MgSO40.5g/L，VB150mg/L；最佳培养温度是24，最佳初始pH值是6.0，最佳培养箱转速时150r/min；并在最佳培养条件下绘制了蛹虫草菌丝体生长曲线，其对数期为第57.5天，菌丝体平均重为7.07g，稳定期为第7.59天，菌丝体重为14.63g，从第9天后，蛹虫草菌丝体开始衰退。关键字：蛹虫草；液体培养；正交试验法IAbstractCordycepsmilitaris,alsoknownastheNorthCordyceps,hastheeffectofcompletingdeficiency,benefitingtheessence,lungandkidney,haemostaticandresolvingphlegm,nourishingandstrong,ItisapreciousChineseherbalmedicinematerials.CordycepsmilitarisinthispaperhashighqualityandisprovidedbytheShenyangInstituteofMicrobiology.Aftertakingslantcultureandliquidcultureprocesses,wegethighqualityCordycepsmilitarismycelia.Ittakesmyceliumweightasanindicatortomakeunivariateanalysisoftheincubationtemperature,initialpHvalueincubatorspeed,thebestcarbonsource,thebestnitrogensourceandthebestinorganicsaltsliquidcultureconditions.Withorthogonaltestmethod,itsestablishedtheoptimummyceliamedium.Theexperimentalresultsshowthatthebestcarbonsourceforthemyceliaisglucose,thebestnitrogensourceispeptone,thebestinorganicsaltisKH2PO4andMgSO4.Aoptimummediumincludesglucose20g/L,peptone10g/L,KH2PO41.0g/L,MgSO40.5g/L,VB150mg/L.Theoptimalincubationtemperatureis24,theoptimalinitialpHvalueis6.0,thebestincubatorspeedis150r/min.ThegrowthcurveofCordycepsmilitarismyceliaisdrawnontheoptimalcultureconditions.Thelogarithmicphaseturnedupatthe5thto7.5thday,themyceliumaverageweighted7.07g,thestabilizationperiodturnedupatthe7.5thto9thday.Themyceliumweighted14.63gandtherecessionbeganfromtheninthday.Keywords:Cordycepsmilitaris;Liquidculture;Orthogonalmethod.II目录摘要.IAbstract.II第一章前言.1第二章文献综述.22.1蛹虫草简介.22.1.1形态特征.22.1.2生长条件.32.1.3功能成分.32.1.4药用价值.52.2蛹虫草培养基的作用.72.2.1碳源.72.2.2氮源.72.2.3无机盐.72.3蛹虫草培养条件的影响.72.3.1初始PH值的影响.72.3.2培养温度的影响.82.3.3摇瓶转速的影响.82.4菌种液体培养及优化.82.4.1单因素试验法.82.4.2正交试验设计法.82.4.3响应面优化设计法.92.4.4二次正交旋转组合法.102.5国内外研究现状.102.6本文研究意义.12第三章实验部分.133.1试验材料.133.1.1菌种.133.1.2培养基.133.1.3主要试剂.133.1.4主要设备.133.2试验方法.143.2.1蛹虫草菌丝体的培养.14III3.2.2蛹虫草菌丝体培养基的优化.143.2.3蛹虫草菌丝体培养条件的优化.163.2.4蛹虫草菌丝体生长曲线的绘制.173.3结果与分析.173.3.1蛹虫草菌丝体培养基的单因素分析与正交试验结果.173.3.2蛹虫草菌丝体培养条件的优化.233.3.3蛹虫草菌丝体生长曲线.26第四章结论与展望.284.1结论.284.2展望.28致谢.29参考文献.300第一章前言蛹虫草，又称北冬虫夏草，主要产自吉林、云南等地带的针阔叶林的鳞翅目昆虫蛹体上，是一种名贵的药用真菌。蛹虫草菌含有多种有效成分，包括核苷类化合物（又称虫草素）、虫草多糖、虫草酸、氨基酸、超氧化物歧化酶（SOD）、维生素及微量元素等7大类具有生物活性和药理作用的化合物1。这些有效成分可以增强人体免疫能力，并具有抗癌、抗病毒等功效2。目前市场上销售的冬虫夏草人工替代品主要是通过3类方法培育的蛹虫草菌：1.用鲜或干蚕蛹体培植出的蛹与草为一体的“蛹体虫草”；2.以大米、小麦等为主要原料，在固态人工合成培养基上培植出的“虫草菌子实体”；3.采用液体深层发酵法培养的蛹虫草菌丝体。在药化、药理和临床试验3均证明它们的主要有效成分可替代天然的冬虫夏草。对蛹虫草菌进行液态发酵培养大量生产菌丝体，比固态培养蛹虫草菌子实体具有周期短、可控性强、功能性有效成分含量高等优点，且利于大规模生产45。液态深层发酵培养蛹虫草菌主要受培养基组成及培养条件的影响，培养基内碳源、氮源和无机盐等物质的成分与含量，培养条件的变化及其各物质间的相互作用对菌丝体生长和产量都有直接影响。因此，对蛹虫草菌优化培养不仅解决了野生虫草资源缺少的问题，也开发了其药用价值，对以后的人类生活产生重大意义。本实验采用单因素法和正交试验法，对蛹虫草的液体培养基及培养条件进行了优化，目的是获得最大量菌丝体的培养基配方。1第二章文献综述2.1蛹虫草简介蛹虫草为子囊菌亚门，麦角菌目，麦角菌科、虫草属的模式种6。学名为Cordycepsmilitaris，又称为北冬虫夏草，野生资源稀少。蛹虫草主要分为子座（即草部分）和菌核（即虫的尸体部分）两部分。虫体外形较完整，体内充实如僵死的老蚕，表皮呈深黄色至黄棕色，背部有横皱纹，腹部有八对足，以中间四对较明显，头部三对不甚清楚，尾部一对隐约可见。菌座细长，呈圆柱形，直立或稍弯曲，上部膨大，表面深棕色至棕褐色，带有不明显的纵皱纹，质地柔韧，端面内心空虚，呈粉白色7。冬季幼虫居住在土里，部分菌类寄生在幼虫体内，从其中吸取营养，使幼虫体内充满菌丝导致死亡。夏季从幼虫的尸体上生出幼苗，形状似草，夏至前后可采集得到。中医认为，虫草主要入肾肺二经，既能补肾阳，又能补肺阴，是唯一的一种能同时调节、平衡阴阳的中药。2.1.1形态特征子座单个或数个从寄主头部或节部生出，颜色以橙黄色为主，一般不分枝，高35cm，子座头部呈棒状，表面粗糙，长12cm，粗35mm；子囊壳下部埋生于子座头部的外层，外露，近圆锥形；子囊线形，细长，大小为(400300)um(45)um，内含8枚线形孢子，粗约1um，孢子细长，几乎充满子囊，成熟时产生横隔，并断成23um的小段；子座柄部近圆柱形，内实心，长2.54cm，粗24mm8。蛹虫草菌丝体由子座单个或数个一起从寄生的蛹体头部或节部长出，颜色为橘红或橘黄色，全长28mm，蛹体的颜色变为紫色，全长约1.52mm。2.1.1.1菌丝体蛹虫草的菌丝是一种子囊菌。当菌体成熟即形成子囊孢子，孢子随风传播，一旦落在合适的虫体上，便开始侵入形成菌丝体。菌丝体一边不断地发育，一边开始缓慢向虫体蔓延，导致蛹虫被真菌感染，菌丝体开始分解蛹体内的组织，吸收蛹体内的营养，为其生长发育提供足够的物质和能量，最后将蛹体完全分解。2.1.1.2子实体通常当蛹虫草菌丝将蛹体内的各组织器官完全分解后，菌丝体开始进入发育新阶段发育。菌丝体由营养生长转为生殖生长，最后集结后从蛹体空壳的各部分伸出，形成呈棒状的子实体，一般为橘黄色或橘红色。见图2-1.2图2-1蛹虫草子实体2.1.2生长条件蛹虫草主要生长在高寒区，高山雪线附近，常于海拔4000m以上的高山上出现，尤其多出现在积雪、排水良好的高寒草甸。最适分布海拔高度为42004600m，下限是3000m，上限是5100m。产区的平均气温为0.28，年降水量556.7651.3mm，气候具有明显的干季和雨季。在我国的分布主产于四川、西藏、青海、云南的高山、亚高山草甸区，近年在辽宁也有发现6,911。蛹虫草的生长需要适宜的营养条件，包括碳源、氮源、无机盐以及维生素，还需要适宜的温度，水分以及光照，酸碱度等。在菌丝生长过程和子实体成长过程需要不同条件，以保证生长最好。2.1.3功能成分蛹虫草含有多种生理活性物质，迄今已检测或分离到多种活性物质如虫草素、腺苷、虫草多糖、虫草酸、超氧化物歧化酶(SOD)以及矿物质元素等12。（1）虫草素虫草素又称虫草菌素，是Cuninghum等人于1951年从蛹虫草寄生的昆虫组织中分离得到的一种腺苷类活性物质，将其命名为虫草素，并确定其结构式为3-脱氧腺苷1314，虫草素分子式为C10H13N5O3，分子量为251，碱性，针状或片状结晶。陈尚卫等研究证明蛹虫草中含有虫草素，蛹虫草子实体中虫草素的含量约为0.053%15；孙月等证明野生蛹虫草子实体中虫草素的含量略高于以大米为培养基的人工栽培蛹虫草子实体中的虫草素含量，以大米为培养基的人工栽培蛹虫草子实体中虫草素的含量高于其菌丝部位1617。通过多项研究表明，虫草素具有多种功效。包括抗肿瘤、抗菌、抗病毒、免疫3调节、清除自由基等多种药理作用，现已在白血病的临床治疗方面开发了新药，并成为虫草领域的研究热点。（2）虫草酸虫草酸即D-甘露醇(D-mannitol)，有关虫草酸的研究证明，野生蛹虫草子实体中的虫草酸含量高于以大米为培养基的人工栽培蛹虫草子实体，以大米为培养基的人工栽培蛹虫草子实体中的虫草酸含量高于大米培养基的菌丝部位，但低于深层发酵菌丝体中的虫草酸含量16；江晓路等测得蛹虫草和冬虫夏草中均含有较高含量的虫草酸，而且在蛹虫草深层发酵菌丝体中，其虫草酸的含量大大高于天然虫草18。相关研究表明，虫草酸具有抗自由基，抗氧化、利尿脱水、镇咳、祛痰平喘的作用，在临床上可用于血管痉挛、脑血栓、肾功能衰竭的治疗19，是虫草的有效成分之一，常作为虫草及其制品的质量检测指标12。（3）虫草多糖虫草多糖是蛹虫草中含量最多的药理活性物质，是一类高分子复合物研究者对蛹虫草粗多糖水溶液的理化性质进行分析，结果表明其具有良好的耐热性、触变性、增稠性、抗盐性，以及对广泛P值的稳定性2021。大量研究表明，虫草多糖有着多种生物活性功能，具有广泛的药理作用。主要具有免疫功效，抗放射作用。虫草多糖还具有抗病毒、抗疲劳、保肝、抗缺氧、抗流涎等多种功效22。(4)腺苷腺苷即腺嘌呤核苷，在生理代谢过程中起着调控作用，可用于治疗心绞痛、心肌梗塞、动脉硬化、原发性高血压及中风后遗症等病症，是虫草的主要活性成分之一，常用作虫草药材和深加工产品的质量检测指标12。（5）超氧化物歧化酶超氧化物岐化酶(S0D)普遍存在于好氧生物体内，是生物细胞防卫系统中重要的一种抗氧化物酶，构成了细胞抗氧化损伤的第一道防线23。在真核生物中主要存在3种SOD同工酶，包括细胞质Cu，Zn-SOD、线粒体Mn-SOD、细胞质Fe-SOD24。许多研究报道表明，丝状真菌的Cu，Zn-SOD具有潜在的额外修饰基团和多聚体2526，可以为解决SOD半衰期短以及体内给药的活性问题等缺陷提供更有效的S0D药用蛋白。蛹虫草含有全部以上3种SOD同工酶，其中Cu，Zn-SOD是一种中性蛋白，占总SOD的9O%以上，是蛹虫草体内主要的SOD2728。张小强等采用邻苯三酚自氧化体系，研究了冬虫夏草及人工虫草菌丝体对超氧阴离子自由基和羟自由基的清除作用，结果表明冬虫夏草和人工虫草菌丝体对超氧阴离子自由基和羟自由基均有清除作用29。另有相关研究表明，蛹虫草子实体中的SOD含量要高于冬虫夏草子实体中的SOD含量。(6)其他活性成分4除此之外，蛹虫草中的活性成分还有肽类化合物、甾醇类化合物等，研究者目前已经从蛹虫草中分离鉴定到谷甾醇、麦角甾醇等多种甾醇及其衍生物，其中麦角甾醇是脂溶性维生素D2的前体，是真菌的特征醇，在蛹虫草中的含量相对恒定，具有防衰老、抗癌、减毒等作用30。虫草中的氨基酸，维生素；无机元素等也是种类繁多，孟庆繁等的研究结果表明，蛹虫草中氨基酸的总量及人体8种必需氨基酸的含量较高，其含量与天然冬虫夏草基本相当，而且蛹虫草子实体中的氨基酸含量高于菌丝体3132。此外，蛹虫草中还含有多种维生素,对蛹虫草功效的开发起到了重要作用。2.1.4药用价值2.1.4.1免疫调节作用蛹虫草的免疫作用主要与蛹虫草多糖有关，蛹虫草多糖在增强免疫能力过程中扮演着重要角色。研究表明，蛹虫草多糖的不同组分均能增加小鼠的胸腺和脾脏的重量，提高机体的体液与细胞免疫。蛹虫草具有促进T和B淋巴细胞增殖作用，明显抑制小鼠脾细胞对刀豆蛋白A和细菌脂多糖的反应；减少小鼠特异抗体分泌细胞数；降低特种异型抗原诱导的迟发型超敏反应及混合淋巴细胞反应；来源于蛹虫草的新型免疫抑制剂FTR720，能直接作用于淋巴细胞，表现出免疫抑制效果，可抑制器官移植等的排斥反应33。戴瑛等34试验得出，蛹虫草提取物可调节小鼠机体组织的免疫功能，可以缓解其由于内毒素或类似物质造成的肺部炎症。徐廷万等35试验得出人工蛹虫草胞外多糖可增强免疫功能被抑制的非特异性免疫功能和体液免疫功能，还有抗疲劳作用。李义等36试验证明口服虫草菌粉可显著地提高罗氏沼虾的免疫功能，有效地预防嗜水气单胞菌的感染。2.1.4.2抗肿瘤作用蛹虫草可以抑制癌细胞发生裂变，并阻碍拖延癌细胞快速扩散，明显提高机体内T细胞和巨噬细胞的吞噬能力。蛹虫草多糖能够有选择地增加脾脏的营养性血液量，使脾脏重量增加，进而导致脾中的浆细胞明显增多，具有抗放射作用。蛹虫草多糖还能增加血清中的皮质酮含量，促进机体内蛋白质和核酸的代谢，具有一定的抑瘤作用。药理试验证明，蛹虫草子实体可明显抑制S180瘤细胞37，其抑制肿瘤的机理已被初步探明38；美国1997年开始将虫草素用于I期临床试验，治疗急性前B和前T淋巴细胞白血病患者。除此之外，他还对人体黑色素瘤B16细胞、人体白血病HL-60细胞、人体红血病K562细胞具有较好的抗肿瘤效果，其效果要优于冬虫夏草20。52.1.4.3抗氧化、抗衰老作用桂仲争等人研究发现，蛹虫草提取物能有效防止D-半乳糖致衰老小鼠的多项衰老体征的出现，具有明显的延缓衰老作用，其作用机理可能与其提高抗氧化酶活性、清除自由基、减少过氧化脂质的生成有关。曹晶等人通过研究发现虫草酸具有促进人体新陈代谢，改善人体微循环系统，明显地降血脂，清除自由基，抑制细菌，增强对疾病的抵抗力等作用，蛹虫草通过对羟自由基的清除作用而保护肝脏。2.1.4.4抗炎、抗菌、镇静作用蛹虫草中的虫草素和虫草酸对葡萄球菌、鼻疽杆菌、猪出血症杆菌、枯草杆菌、鸟型结核杆菌等都有明显的抗拒和抑制作用。其抗炎效果相当于氢化考地松。虫草水提取物具有能降低巴豆油引起的小鼠耳部水肿的作用，能减轻蛋清诱发的大鼠足水肿。试验表明，其有显著抑制肉芽增生和镇静的作用39。2.1.4.5对内分泌功能的影响蛹虫草能增加睾丸的生精与内分泌功能，并能修复腺嘌呤引起的睾丸功能障碍，使大鼠血清睾酮含量增加，同时使其体重及皮腺、精囊和前列腺的质量显著增加，增强去势大鼠的质量，有明显的雄性激素样作用40。临床实验证明，蛹虫草对肾虚所致的阳痿早泄有良好的治疗及保健作用，对肾虚腰痛、糖尿病、蛋白尿等肾功能障碍患者也有较好的治疗效果41。2.1.4.6促进造血作用蛹虫草具有显著的促进生血作用。冬虫夏草醇提物可明显提高小鼠骨髓造血干细胞(CFU-S)的产率和自杀率，可改变小鼠骨髓CFU-S的周期状态，促使它们从G0期进入S期，从而促进CFU-S增殖。冬虫夏草醇提物还可明显促进小鼠骨髓粒-单系祖细胞(CFU-GM)及骨髓红系祖细胞(CFU-E)的增殖，还可拮抗三尖杉酯碱所致CFU-GM的严重抑制，使其保持于正常水平42。2.1.4.7对呼吸系统的作用虫草菌丝体具有抑制金黄色葡萄球菌、肺炎球菌和乙型链球菌的作用43。另外,冬虫夏草能扩张支气管、祛痰平喘。在临床上能用于治疗慢性阻塞性肺疾病(COPD)、治疗肺间质病、防治老年反复呼吸道感染疾病、辅助治疗复治肺结核、辅助治疗肺原性心脏病呼吸衰竭44。62.1.4.8其他作用除以上功效外，蛹虫草还有多种功效，包括抗病毒，护肝，调节心血管，调节肾脏，调节脂代谢，耐缺氧，耐高低温等。随着蛹虫草功效成分的日渐清晰，蛹虫草也将在医学保健领域发挥更大的作用。2.2蛹虫草培养基的作用2.2.1碳源碳源是微生物生长所必需的营养元素，为微生物的生长提供能量，是微生物合成蛋白质，氨基酸的重要基础。培养蛹虫草的培养基中，需添加可利用的碳源，主要有葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉等，其中以葡萄糖、蔗糖等小分子糖利用率最高。在配制培养基时要选择合适的碳源，以保证菌丝体得到最高产量。2.2.2氮源氮源是构成生物体中蛋白质，核酸等的重要物质。在微生物培养过程中，也是不可或缺的营养元素之一。氮源包括有机氮源和无机氮源，其中有机氮源通常能够被动物及部分细菌利用，包括蛋白胨、牛肉膏、花生饼粉、黄豆饼粉、酵母粉、麸皮等。无机氮源通常被高等植物、部分细菌、霉菌等利用，主要包括磷酸二氢铵、硝酸铵、氯化铵等。培养蛹虫草菌丝体，有机氮源利用率较高。因此，选择适当氮源，可提高菌丝体产量。2.2.3无机盐对于生物体的生长，无机盐需要量微小，但其发挥的作用不容忽视。通过添加无机盐，保证微生物对矿质元素的需求。选择适量无机盐，有利于微生物快速生长。2.3蛹虫草培养条件的影响2.3.1初始PH值的影响培养液中的pH值会影响到细胞内pH值的变化,进而影响细胞内的酶活性,也影响到蛹虫草菌对一些微量元素的利用45。因此，选择合适的PH值，对蛹虫草菌丝体的生长有着重大影响。72.3.2培养温度的影响温度会影响细胞的酶活和发酵液的溶氧量。很多虫生真菌的最适生长温度都在20一30之间46。酶活性会根据温度的变化而变化，从而影响细胞的生长量。选择适宜温度，保证酶活性最强，得到高产量的微生物。2.3.3摇瓶转速的影响摇瓶转速可以影响深层液体培养时发酵液的溶氧量，进而影响真菌的生长和代谢产物的形成46。通过调节摇瓶转速，来保证菌丝体的产量以及代谢产物的形成。2.4菌种液体培养及优化液体培养即配制液体培养基对菌种进行培养，可使其深层培养、产量高、易控制、还可对过程进行精确调控。液体培养的优化有多种优化方法，包括单因素试验法、正交设计试验法、响应面优化设计法、二次正交旋转组合法等。下面简单介绍以上几种方法。2.4.1单因素试验法单因素试验法作为优化培养的传统方法，简单，易行，结果直观，但对于考察多因素的优化培养，不仅浪费时间，更容易产生错误的结论，故常用作初步优化试验。单因素试验是在假设各因素之间不会相互影响的前提下，通过每次只改变一个因素，保证其他因素不变的条件下，研究不同因素对结果的影响，通过对逐个因素的考察，做最初的优化培养。王晓辉47等人利用单因素试验对BS070623蛋白酶高产突变株进行了发酵培养基优化试验，取得了良好效果。然而，对于大部分组分相当复杂的培养基而言，仅通过单因素试验通常无法达到最优的效果，特别是在影响因素很多的情况下，要完成各因素的逐个优化，需要较多的时间来进行试验，因此，单因素试验经常被用在正交试验之前或与均匀设计、响应面分析等结合使用4849。利用单因子试验和正交试验相结合的方法，通过少量试验确定各因素之间关系以及最佳培养基配方法。较常见的优化培养方法是先通过单因素试验确定最佳碳、氮源，再进行正交试验，或者通过单因素试验直接确定最佳碳氮比，再进行正交试验50。2.4.2正交试验设计法正交设计试验法是利用正交表格，设计存在相互作用并有随机误差的多因素试验，利用普通的统计学方法来分析试验结果。正交设计试验法对影响因素要求低，8不论个数多少，相互之间是否有影响，均可使用。利用正交表可在多种水平的组合中，选出最具有代表性的试验点进行试验，在此过程中，可分析全面，大大减少试验次数，并能通过试验分析找出好的试验点。利用正交设计试验得出的结果可能与传统的单因素试验法的结果一致，但正交试验设计考察因素及水平合理、分布均匀，不需进行重复试验，误差便可估计出来，因而计算精度较高51，正交试验在试验因素多且各个因素间交互作用复杂时，凸显其优势。孟和毕力格52等人利用正交试验对传统乳制品中产-GABA乳酸菌培养基进行了优化，获得了满意结果，采用优化后的培养基于32发酵培养96h，产物含量高达10.78g/L。钟为章53等人采用L16(45)正交表对红螺菌科光合细菌液体培养基组成进行了优化，利用优化培养基在光照3000lx、（322）条件下培养3d，细菌总数由1.63109cfu/mL增殖至3.68109cfu/mL。蔡成岗54等人以角蛋白酶为考察指标，采用正交试验对枯草芽孢杆菌菌株KD-N2生产角蛋白酶培养基进行了优化研究，产物酶活力可达到(66.52.04)U/mL。正交试验法更全面，更精确的描述了各因素之间的作用，确定最佳培养方案。2.4.3响应面优化设计法响应面方法(ResponseSurfaceMethodology，简称RSM)是利用合理的试验设计并通过实验得到的一定数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法55。RSM在优化研究中应用频繁，是降低开发成本、优化加工条件、提高产品质量、解决生产过程中的实际问题的一种有效方法，它已广泛地应用于农业、生物、食品、化学、制造等领域56。一般可通过Plackett-Burman(PB)设计法或Centralcompositedesign(CCD)等从众多因素中精确估计有主效应的因素，节省实验工作量5758。响应面分析法以回归法作为函数估算的工具，将多因子试验中因子与试验结果的相互关系，用多项式近似，把因子与试验结果(响应值)的关系函数化，依此可对函数的面进行分析，研究因子与响应值之间、因子与因子之间的相互关系，并进行优化。周海鸥59等人应用PB设计法对影响桑黄发酵的培养基组成进行筛选，再采用CCD设计结合响应面对影响菌丝得率的关键因素最佳水平进行了深入研究，并通过二次方程回归求解得到最优化条件，此模型与预测值极为接近，吻合性较好。姜丽艳60等人应用PB设计法对影响乳链菌肽液体发酵培养基组分进行了筛选，然后采用最陡爬坡实验逼近3个关键因素的最大响应区域，找到了最优化的水平，在此培养条件下进行发酵培养，发酵液中乳链菌肽效价为6033U/mL，是优化前的4.48倍。钟国华61等人采用中心组分旋转设计技术，根据菌丝干重和高效氯氰菊酯降解率，按照统计学要求检测模型显著性，9分析了配方组合对降解菌生长量、高效氯氰菊酯降解率的影响和效应，采用二次多项式逐步回归分析模型，根据响应面模型和预测回规模型方差分析对模型进行评价，以确定最佳培养基配方。利用优化培养基进行培养，菌体干重为450.30mg/50mL培养菌液，处理24h对50mg/L高效氯氰菊酯降解率高达93.78%。2.4.4二次正交旋转组合法以上方法由于试验设计及结果分析简单，易于实际应用，故广泛应用于微生物培养的优化。但由于既不能对各组分进行定量分析，又不能预测产量。所以，在正交设计试验法的基础上，加入组合设计和旋转设计的思想，并与回归分析方法有机结合，建立了二次回归正交旋转组合设计法(rotationregressionorthogonalcombination)，它不仅基本保留了回归正交设计的优点，还能根据测量值直接寻求最优区域，适用于分析参试因子的相互作用。它既能分析各因子的影响，又能建立定量的数学模型，属更高层次的试验设计技术。基本思路是利用回归设计安排试验，对试验结果用方程拟合，得到数学模型，利用计算机对模型进行图形模拟或数学模拟，求得模型的最优解和相应的培养基配方，并在一定范围内预估出在最佳方案时的产量62，与响应面法有相似之处。张钟元63等人为了提高Proteusmirabilis产L-肉碱脱水酶的活力，通过单因素试验研究了碳源、氮源及诱导物等对酶生物合成的影响的基础上，采用二次正交旋转组合设计优化了培养基组分配比，使L-肉碱脱水酶活力由最初的1.90U/mL提高到了5.32U/mL，与模型预测值较为接近，取得了预期效果。刘晓永64等人为提高酵母菌中-葡聚糖的含量，在单因素试验基础上，应用二次正交旋转组合法设计培养基成分，获得了优化后的培养基配方，培养基经优化后，酵母菌中-葡聚糖产量由原来的65.80mg/100mL提高至108.18mg/100mL，获得了满意的结果。2.5国内外研究现状蛹虫草初始的药用来源于中国，但最早在国外开始研究，Vaillant于1723年在(BotaniconParisiense)中报道了大团囊虫草和蛹虫草，20世纪以前人们只对野生蛹虫草进行研究，20世纪3060年代，国外研究人员进行了有关蛹虫草生态调查和驯化、人工栽培的研究。我国对蛹虫草的研究起步较晚，始于20世纪80年代，1986年我国科研人员首次以家蚕和柞蚕为寄主培养蛹虫草成功获得子实体65，后又以柞蚕和桑蚕活蛹、家蚕、蓖麻蚕蛹以及樗蚕蛹为寄主在室内种植蛹虫草获得成功6667，这标志着我国掌握了蛹虫草的人工栽培技术，为蛹虫草的开发应用奠定了基础。目前，我国研究人员已在蛹虫草人工栽培、化学成分、药理、开发应用等方面做了广泛的研10究，取得了一些成果68。近年来野生冬虫夏草逐渐在减少，为保证资源的供给，蛹虫草已逐渐实现人工栽培，通过对其不断的研究与开发，使其逐步成为野生资源的替代品，并开发出多种功效，深受多国消费者喜爱。现代医学研究证明，蛹虫草含虫草素、虫草酸、虫草多糖、核苷腺苷、超氧化物歧化酶(SOD)、氨基酸、维生素等生物活性成分，含有钾、钠、钙、镁、铁、铜、锰、锌、硒等微量元素。虫草多糖是蛹虫草的重要成分之一，盖新杰等69从蛹虫草菌丝体培养液中提取的水溶性粗多糖经分离纯化，得到一种含少量蛋白的半乳甘露聚糖CM-I，糖组成(半乳糖：甘露糖)摩尔比为6：5；核苷类化合物被认为是蛹虫草抗肿瘤、抑菌、抗病毒物质，至今已从虫草及发酵菌丝中分离鉴定的核苷类化合物有：腺嘌呤、腺苷、脲嘧啶、尿苷、鸟嘌呤、次黄嘌呤核苷、胸腺嘧啶、虫草素、N6-甲基腺苷、O5-乙酰基虫草素、N6-(乙酰胺甲酰)氧乙基腺苷7071；蛹虫草含l8种氨基酸，种类齐全且含量高，其中最高的是谷氨酸和天冬氨酸，人体必需的8种氨基酸含量较高，比例适当19；环状肽类可作为免疫剂和抗真菌剂，姜泓等71从蛹虫草子实体中分离出了虫草环肽A；张显科等72测出蛹虫草含多种重要的维生素和超氧化物歧化酶(S0D)等蛋白质酶类，其中VB6含量最高，VB1和VBl2较高；蛹虫草还含有其他活性物质。迄今为止人们共分离鉴定到9种甾醇及其衍生物73，分别为麦角甾醇、麦角甾醇过氧化物、胆固醇、-谷甾醇、胡萝卜苷、菜油甾醇、二氢菜籽甾醇和黄豆醇；王刚等74从人工蛹虫草子实体中分离得到了软脂酸等有机酸类化合物。赵余庆等75报道了蛹虫草的虫草素含量比西藏产冬虫夏草的含量高，氨基酸和微量元素的含量基本相近；汤晓云等76报道了蛹虫草的虫草素和蛋白质含量比冬虫夏草的含量高，而虫草多糖的含量比冬虫夏草低；贡成良等77对家蚕蛹虫草的化学成分分析的结果表明，蛹虫草的虫草素、腺嘌呤的含量是冬虫夏草的3倍。都兴范等78对其主要成分的含量进行了分析测定，结果表明，蛹虫草中的虫草素、虫草酸、虫草多糖和蛋白质含量都明显高于冬虫夏草，尤其是虫草素、虫草酸和虫草多糖的含量分别为冬虫夏草的2.9、2.7和3.2倍，而氨基酸含量基本接近。孟庆繁等31对人工培养蛹虫草与青海产野生冬虫夏草的氨基酸含量进行测定，结果表明，人工培养蛹虫草的精氨酸及脯氨酸含量明显高于野生冬虫夏草。这些研究结果为蛹虫草替代冬虫夏草提供了科学的理论依据。经研究发现，各活性成分都表现出一定的功效。王根维等的实验研究报道79,冬虫夏草提取物具有免疫功能正向调节作用,可增强巨噬细胞吞噬功能,提高机体免疫功能。贾保祥等的实验研究表明80虫草制品有调节体液免疫、细胞免疫、巨噬细胞和NK细胞免疫的功能,并对正常动物和高血糖模型的动物血糖耐量有一定的增强作用,但对正常动物空腹血糖无影响,冬虫夏草对环孢素引起的血糖升高有明显降血糖作用,对环孢素引起的胰岛素下降有一定抑制作用。诸多研究表明81,冬虫夏草可改善患者肝功能,减轻肝脏的炎性细胞浸润和肝细胞变形坏死,虫草菌丝有较强的11促肝细胞修复作用。冬虫夏草及其制剂对肾脏疾病有多种治疗作用。东北冬虫夏草具有中枢抑制作用,即镇静、催眠、抗惊厥作用。冬虫夏草菌丝体具有镇咳、祛痰及消炎作用6。孙祥环等通过研究认为82,冬虫夏草营养液具有抗衰老作用。蛹虫草不仅在医疗保健方面有重要功效，在食品产业方面也有待探究。作为新兴绿色健康食品，蛹虫草具有广阔的发展前景。2.6本文研究意义虫草是一类名贵稀缺的药用资源，随着需求量大增，野生资源并不能满足需求。所以人们开始研究人工栽培蛹虫草，通过不断探究，得到最适宜培养基，培养条件，选育出药理成分高的品种，保证人工蛹虫草与野生虫草在活性成分以及药理作用上无很大差异，但在价格上大大低于野生虫草，加强蛹虫草在医药，食品领域的应用，使大量蛹虫草可代替野生虫草发挥功效。12第三章实验部分3.1试验材料3.1.1菌种蛹虫草优质菌种，沈阳微生物研究所提供3.1.2培养基葡萄糖分析纯北京化工厂蔗糖分析纯北京化工厂麦芽糖分析纯北京化工厂蛋白胨生化试剂北京奥博星生物技术有限责任公司酵母膏生化试剂北京奥博星生物技术有限责任公司牛肉膏生化试剂北京奥博星生物技术有限责任公司磷酸二氢钾分析纯北京化工厂硫酸镁分析纯天津市津北精细化工有限公司维生素B1生化试剂上海惠世生化试剂有限公司琼脂生化试剂北京化工厂3.1.3主要试剂（1)氢氧化钠分析纯北京化工厂（2）乙醇分析纯北京化工厂3.1.4主要设备（1）分析天平，感量0.0001g，北京赛多利斯天平有限公司；（2）低温冰箱，中国海尔集团有限公司；（3）SHB循环水式多用真空泵，巩义市英峪予华仪器厂；（4）OHG-9143BS-III电热恒温鼓风干燥箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；（5）万用电炉，北京科伟永鑫实验仪器设备厂；（5）YXQ-LS-50SII立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；（6）HZQ-F160全温振荡培养箱，太仓市华美生化仪器厂；133.2试验方法3.2.1蛹虫草菌丝体的培养3.2.1.1斜面培养通过分析天平称取适量碳源、氮源、无机盐、生长因子和琼脂，加水配制培养基，煮沸，放入灭菌锅中灭菌，再移至无菌操作室中杀菌，待其冷却分装到试管，使其倾斜放置，液面不超过试管体积的2/3。而后接菌划线，待其生长备用。3.2.1.2液体培养通过分析天平称取适量碳源、氮源、无机盐及生长因子，加水配制液体培养基，将配制好的培养基用烧杯盛放，放在电炉子上加热直至沸腾，调节其pH值为6.0，再加热至沸腾。取下烧杯将每组培养基分装到三角瓶并封口，将已分装好的培养液放入灭菌锅进行灭菌，灭菌温度为121，灭菌时间为30min，灭菌结束后，取出培养基，转移到无菌操作室，准备接菌。在接菌前，需准备已培养好的冷藏的蛹虫草菌丝体菌种，酒精灯，接菌环等实验用品，一同放入无菌工作台，紫外杀菌30min。而后关闭紫外灯，开始接菌。先将伸入工作台的手和胳膊用酒精棉擦过，再将装菌种的试管用酒精棉擦拭，点燃酒精灯，左手拿试管底部，右手拿接菌环，开始接菌。接菌完毕后将装有培养基的三角瓶放入全温振荡培养箱，设置培养箱转速150r/min，培养温度24，培养时间为8d。8d过后，取出三角瓶，用循环水式多用真空泵进行抽滤，取其滤饼称重，根据滤饼重量确定优化条件。3.2.2蛹虫草菌丝体培养基的优化3.2.2.1最佳碳源的选择以蛋白胨10g/L,KH2PO41.0g/L,MgSO40.5g/L,VB150mg/L为基础培养基，分别以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖作为碳源，使用分析天平称取葡萄糖、蔗糖、麦