第九章革兰氏阴性兼性厌氧

第九章革兰氏阴性兼性厌氧杆菌 第一节肠杆菌科概述 肠杆菌科 Enterobacteriaceae 为一大群革兰氏阴性杆菌 根据生化反应 血清学试验 DNA同源性研究 本科至少包括28个菌属 110个以上的菌种 本科细菌广泛分布于自然界 包括腐生菌 寄生菌和人及动物的病原菌 多数是人和动物肠道正常菌群的重要成员 只有少数生活在植物及水和土壤中 沙门氏菌属 志贺氏菌属以及埃希氏菌属和耶尔森氏菌属的部分成员对人或动物具有广泛的致病性 在公共卫生和兽医临诊上都有重要意义 第二节埃希氏菌属 Escherichia 本属中最重要的菌种是大肠埃希氏菌 Escherichiacoli 俗称大肠杆菌 为德国科学家Escherich首先发现 1885年 长期以来 一直认为大肠埃希氏菌是人和动物肠道内正常菌群的重要成员之一 维持着肠道的正常生理功能 但后来的许多研究 发现一些特定血清型可致畜禽的疾病 给畜牧业造成危害 对大肠杆菌的正确认识 是人和动物肠道正常菌群成员之一 某些血清型可引起畜禽的疾病 在环境卫生和食品卫生学上 常被用作粪便直接或间接污染的检测指标 本菌还是分子生物学和基因工程中重要的实验材料和研究对象 一 形态及染色特性 1 G 直杆菌 大小0 4 0 7 1 3 m 两端钝圆 散在或成对 无芽胞 2 大多数菌株具有鞭毛 但也有无鞭毛或丢失鞭毛的变异株 3 多数菌株有菌毛 少数菌株兼有性菌毛 菌毛与毒力相关 4 除少数菌株外 通常无可见荚膜 但常有微荚膜 二 培养及生化特性 1 培养特性 兼性厌氧 最适生长温度37 最适生长pH7 2 7 6 普通琼脂 生长良好 圆形凸起 光滑 湿润 半透明 灰白色菌落 直径约2 3mm 肉汤培养 均匀浑浊 管底有粘性沉淀 液面管壁有菌环 麦康凯琼脂 红色菌落 伊红美蓝琼脂 黑色带金属闪光的菌落 SS琼脂 一般不生长或生长较差 生长者呈红色 血平板 一些致病性菌株常 溶血 2 生化特性 能发酵多种糖类 产酸产气 多数菌株发酵乳糖 约半数菌株不分解蔗糖 IMViC 几乎均不产生硫化氢 不分解尿素 其余生化反应见课本 三 抗原及血清型 1 大肠杆菌抗原主要有O K和H三种 1 O抗原 即菌体抗原 化学本质 多糖 磷脂 蛋白质复合物 耐热 121 2h不破坏其抗原性 每个菌株只含有一种O抗原 其种类以阿拉伯数字表示 可用抗O单因子血清通过凝集试验鉴定 2 K抗原 即荚膜抗原 个别位于菌毛中 不耐热 O不凝集性 具有K抗原的菌株不会被其相应的抗O血清凝集 3 H抗原 即鞭毛抗原 不耐热 80 可破坏其抗原性 1个菌株仅有1种H抗原 2 血清型 可用O K H排列表示其血清型 如 O8 K23 H19 表示该菌具有O抗原8 K抗原23 H抗原为19 致人畜腹泻的产肠毒素大肠杆菌 除含K抗原外 还可含有蛋白质性粘附素抗原 对粘附素抗原应并列写于多糖K抗原之后 如 O8 K87 K88 H19中K88即为粘附素抗原 四 致病性 1 多数是条件致病菌 只在特定条件下致病 如 侵入肠外组织或器官 2 少数特定的血清型是病原性大肠杆菌 正常情况下极少存在于健康机体内 3 据毒力因子与发病机制 致病性大肠杆菌分为 1 产肠毒素大肠杆菌 enterotoxigenicE coli ETEC 2 产志贺毒素大肠杆菌 shigatoxin producingE coli STEC 3 肠致病性大肠杆菌 enteropathogenicE coli EPEC 4 肠侵袭性大肠杆菌 enteroinvasiveE coli EIEC 5 肠出血性大肠杆菌 enterohemorrhagicE coli EHEC 6 肠粘附性大肠杆菌 enteroadherentE coli EAEC 其中研究的最清楚的是前二类 一 产肠毒素大肠杆菌 ETEC ETEC是致人和幼畜腹泻最常见的病原菌 毒力因子有粘附素性菌毛和肠毒素 二者密切相关且缺一不可 否则不引起腹泻或只致轻度腹泻 1 粘附素性菌毛 1 是一类特有菌毛 能粘附于宿主小肠上皮细胞 对其抗原亦相应称作粘附素菌毛抗原 2 动物ETEC的粘附素主要有K88 K99 987P和F41 其他 F18ac F42 F17 F165等 粘附素不是腹泻的直接致病因子 但它是感染的首要毒力因子 ETEC首先粘附于宿主小肠上皮细胞 在肠内定居和繁殖 从而增强细菌的致病性 2 肠毒素 enterotoxin 1 是ETEC分泌到胞外的一种蛋白质性毒素 2 根据对热的耐受性可分为 不耐热肠毒素 heat labileenterotoxin LT 和耐热肠毒素 heat stableenterotoxin ST 3 ETEC的致病机制 二 产志贺毒素大肠杆菌 STEC STEC 产生志贺毒素的病原性大肠杆菌 在兽医临床主要与猪的水肿病 犊牛出血性结肠炎 幼兔腹泻等疾病相关 STEC有两类毒力因子 1 粘附性菌毛 多为F18ab菌毛 少数为K88等 大多数猪水肿病菌株 主要为O139 O141 O138 都有该菌毛 F18ab菌毛是一个重要的毒力因子 有助于STEC在猪肠粘膜上皮细胞上定居和繁殖 2 志贺毒素2型变异体 shigatoxinvariant Stx2e 1 Stx2e是一种蛋白质性细胞毒素 是引起猪水肿病的直接毒力因子 2 仔猪水肿病是一种肠毒血症 发病机制为 大肠杆菌以其菌毛粘附于小肠上皮细胞 细菌定居和大量繁殖 在肠内产生Stx2e并被吸收 3 Stx2e的作用机制 Stx2e在肠道内被吸收 B亚单位与上皮细胞的Gb4受体特异性结合 A亚单位进入细胞内并造成细胞死亡和组织病变 Stx2e可引起血管内皮损伤 血管通透性改变 导致病猪出现水肿和典型的神经症状 神经症状是由脑水肿所致 并非毒素对神经细胞的直接作用 三 大肠杆菌致病性有关的其他毒力因子除了毒素和菌毛外 内毒素 LPS 具有抗吞噬作用的K抗原 溶血素 大肠菌素V 血清抵抗因子 铁离子清除因子等在不同动物大肠杆菌病的发生中可能起到不同的致病作用 五 微生物学诊断 畜禽致病性大肠杆菌的分离与鉴定程序 1 病料的采集 败血症病例 病变的内脏组织 在麦康凯上划线分离培养 腹泻及水肿病病例 小肠粘膜刮取物在麦康凯上划线分离培养2 畜禽致病性大肠杆菌的分离与鉴定程序 畜禽致病性大肠杆菌的分离与鉴定程序 3 ETEC肠毒素检测 1 检测LT的常用方法 兔回肠结扎肠试验 ELISA 中国地鼠卵巢细胞 CHO 培养法 平板免疫溶血试验 夹心红细胞免疫试验 2 检测ST常用方法有 乳鼠胃内投服试验 GM1 ELISA等 4 Stx2e的检测 1 Vero细胞毒性试验 2 小鼠神经毒性试验 3 抗Stx2e抗体中和试验 4 PCR方法对Stx2e基因特异序列的扩增 第三节沙门氏菌属 Salmonella 沙门氏菌属是一大群寄生于人和动物肠道内 生化特性和抗原结构相似 兼性厌氧 G 无芽胞直杆菌 在医学 兽医和公共卫生上均十分重要 许多沙门氏菌对人和动物有致病性 能致人和动物多种不同临床表现的沙门氏菌病 一 形态及染色特性 1 呈直杆状 0 4 0 7 1 0 3 0 m G 2 除鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌外 其余各菌 周生鞭毛 绝大多数具有菌毛 二 培养及生化特性 1 培养特性 1 培养特性与埃希氏菌属相似 2 鸡白痢 鸡伤寒 羊流产和甲型副伤寒等沙门氏菌在普通琼脂上生长贫瘠 培养基中加入血清 葡萄糖 硫代硫酸钠 胱氨酸 脑心浸液和甘油等均有助于本菌生长 3 本菌属有S R变异 4 麦康凯上 大多形成无色菌落 不发酵乳糖 SS平板上 形成黑色菌落 2 生化鉴别 1 本菌属的具体生化鉴别可参考课本 2 大多数沙门氏菌具有以下特性 三 抗原结构 菌体 O 抗原 分群 鞭毛 H 抗原 分型 毒力 Vi 抗原 微荚膜成分 1 O抗原 58种 1 细胞壁表面的耐热多糖抗原 2 根据O抗原分为 A B C1 C4 D1 D3 E1 E4 F G1 G2 H Z和O51 O63以及O65 O67计51个O群 包括58种O抗原 2 H抗原 63种 1 蛋白质性鞭毛抗原 计有63种 2 同一O群沙门氏菌根据H抗原的不同可分成不同的血清型 3 Vi抗原 1 为微荚膜成分 相当于K抗原 与毒力 virulence 有关 故称为Vi抗原 2 其抗原性弱 刺激机体产生短暂低效价抗体 伴随活菌一起存在 测定Vi抗体有助于检出带菌者 3 新分离的菌株多有Vi抗原 但在普通培养基上多次传代后易丢失此抗原 这种变异称为 V W变异 4 血清型 1 以O H Vi形式表示 2 目前本菌属至少已有2300个血清型 对人和温血动物致病的血清型绝大多数分属于A F群 在疾病中经常出现的不足50种 例如 雏沙门氏菌 鸡白痢沙门氏菌 1 9 12 鸡沙门氏菌 鸡伤寒沙门氏菌 1 9 12 鼠伤寒沙门氏菌 1 4 5 12 i 1 2 四 致病性及免疫性 1 动物宿主广泛 人畜共患病 最常侵害幼 青年动物 发生败血症 胃肠炎及其它组织局部炎症 成年动物多引起散发性沙门氏菌病 发生败血症的怀孕母畜可表现流产 2 隐性感染或康复带菌 可间歇排菌 主要传染来源 3 野鸟 啮齿动物 蜱和一些昆虫也可传播 4 主要传染途径是消化道 5 许多环境条件 如 卫生不良 过度拥挤 气候恶劣 内服皮质类激素 分娩 长途运输 发生病毒或寄生虫感染等 均可增加易感动物发生沙门氏菌病 一 致病性类型 根据沙门氏菌对宿主适应性或嗜性不同 可将沙门氏菌分成三群 第一群 专嗜性或高度适应性 只对人或某种动物产生特定的疾病 属于这群的不多 如 鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌 仅使鸡和火鸡发病 马流产沙门氏菌 马流产 牛流产沙门氏菌 牛流产 羊流产沙门氏菌 羊的流产 猪伤寒沙门氏菌 仅侵害猪 伤寒与甲 乙 丙三型副伤寒以及仙台等血清型高度适应于人类 对动物不引起自然感染 第二群 偏嗜性 多多少少适应于特定动物 仅个别血清型 如 猪霍乱和都柏林沙门氏菌 分别对猪和牛羊为强适应性 多在各自宿主中致病 但也能感染其它动物 现在常可从羔羊腹泻中分离到亚利桑那沙门氏菌 并认为这型菌正在适应于羊 第三群 泛嗜性或非适应性 具有广泛的宿主感染谱 能致人和各种动物的疾病 具有重要的公共卫生意义 占大多数 鼠伤寒和肠炎沙门氏菌是其中二个突出代表 常见的危害人和动物的泛嗜性沙门氏菌约20余种 加上专嗜性和偏嗜性菌型有30余种 二 沙门氏菌的致病 毒力 因子许多研究资料表明 沙门氏菌具有多种可能的毒力因素 其中主要的有 1 粘附因子 为沙门氏菌的纤毛成分 能与肠上皮细胞的甘露糖结合 2 脂多糖 LPS 内毒素 引起发热 粘膜出血 白细胞减少 弥散性血管内凝血 循环衰竭等中毒症状以及休克死亡 3 肠毒素4 侵袭蛋白 使得沙门氏菌能侵入并穿越小肠粘膜上皮细胞层 而到达下层组织 使得菌细胞被吞噬细胞吞噬后 不被杀灭并可在细胞内继续生长繁殖 5 诱导巨噬细胞凋亡 沙门氏菌侵入巨噬细胞后可通过激活细胞的酶系统而引起巨噬细胞的凋亡 与在巨噬细胞中存活有关 三 免疫性1 细胞内寄生细菌的清除依赖于细胞免疫 2 细胞外寄生细菌的清除依赖于体液免疫五 微生物学诊断 常用增菌培养基 亮绿 胆盐 四硫磺酸钠肉汤 四硫磺酸盐增菌液 亚硒酸盐增菌液 亮绿 胱氨酸 亚硒酸氢钠增菌液 等等常用鉴别培养基 麦康凯琼脂 SS琼脂 伊红美兰琼脂 去氧胆盐钠 枸橼酸盐琼脂 HE琼脂 三糖铁斜面 尿素琼脂 等等六 防制1 疫苗接种 2 严格实行卫生检验和检疫规程 3 有效的抗生素 由于本属菌的耐药菌株不断在增加 最好使用经药敏试验选定的高敏药物用于治疗病畜禽 第四节其它肠道杆菌 Otherentericbacilli 一 耶尔森氏菌属 Yersinia 1 本菌属现有11个种 1980年被正式归入肠杆菌科 对人和动物有致病性的主要是 1 鼠疫耶尔森氏菌 Y pestis 简称鼠疫杆菌 2 假结核耶尔森氏菌 Y pseudotuberculosis 3 小肠结肠炎耶尔森氏菌 Y enterocolitica 另外 鲁氏耶尔森氏菌是蛙科鱼类尤其硬头鳟的肠型红口病 entericredmouthdisease 的病原 2 生物学特性 1 G 运动或不运动 多形性短小杆菌 2 除鼠疫耶尔森氏菌外 22 28 有鞭毛 37 无鞭毛 3 氧化酶阳性 H2O2酶阳性 能发酵葡萄糖 尿素酶阳性 除鼠疫和鲁氏二种耶尔森氏菌 氨酸脱羧酶阳性 除鼠疫和假结核二种菌 4 V P试验 22 25 阳性 37 阴性 而鼠疫和假结核耶尔森氏菌总是阴性 二 克雷伯氏菌属 Klebsiella 1 现可分成五个种和三个亚种 1 肺炎克雷伯氏菌 K pnenmoniae 肺炎亚种 臭鼻亚种 鼻硬结 2 催娩克雷伯氏菌 K oxytoca 3 土生克雷伯氏菌 K terrigena 4 植生克雷伯氏菌 K planticala 5 变形克雷伯氏菌 K preteus 2 分布 人和动物的肠道 呼吸道以及水 土壤和谷物中 3 形态 G 较粗短的直杆菌 0 3 1 0 0 6 6 m 单个 成对或短链状排列 无鞭毛和芽胞 有荚膜 多数有菌毛 4 兼性厌氧 营养要求一般 5 发酵多种糖类产酸产气 IMViC 尿素酶阳性 不产生H2S 6 肺炎克雷伯氏菌为条件致病菌 在动物抵抗力降低时 引起大叶性肺炎 子宫炎 乳房炎等 三 变形杆菌属 Proteus 1 本菌属为 G 杆菌 无荚膜 无芽胞 周生鞭毛 有菌毛 大小0 4 0 8 1 0 3 0 m 有明显多形性 球状或长丝状 2 包括四个种 普通变形杆菌 P vulgaris 奇异变形杆菌 P mirabillis 潘纳氏变形杆菌 P penneri 产粘液变形杆菌 P myxofacienes 3 有鞭毛能运动 尿素酶阳性 能产生硫化氢 苯丙氨酸脱氨基阳性 4 兼性厌氧5 有溶血现象 四 志贺氏菌 Shigella 第五节巴氏杆菌属与里默氏杆菌属 巴氏杆菌科是一群个体微小 粗短 卵圆形的G 杆菌 为法国微生物学家 化学家巴斯特最早发现 故名巴氏杆菌科 巴氏杆菌属细菌主要的菌种 1 多杀性巴氏杆菌 P multocida 2 溶血性巴氏杆菌 P haemolytica 3 脲巴氏杆菌 P ureae 4 嗜肺巴氏杆菌 P pneumotropica 其中多杀巴氏杆菌和溶血巴氏杆菌是引起畜禽巴氏杆菌病的主要病原体 一 多杀巴氏杆菌 1 形态特性 1 G 细小短杆菌 两端钝圆 中央凸起 近似椭圆形 2 无芽胞 无鞭毛 有荚膜 3 两极染色 美兰或瑞氏染色 2 培养特性 1 需氧或兼性厌氧 2 最适温度37 pH7 2 7 4 3 营养要求稍高 普通培养基中加蛋白胨 血液 血清或微量血红蛋白时可促进生长 麦康凯琼脂上不生长 4 菌落形态 血琼脂 血清琼脂 光滑 湿润 水滴样 边缘整齐 淡灰白小菌落 不溶血 血清肉汤或胰蛋白胨肉汤 均匀混浊 轴性沉淀 形成菌环 3 生化特性 分解葡 蔗 果 甘露和半乳 产酸不产气 大多数发酵甘露醇 一般对乳糖 鼠李糖 杨苷 肌醇 菊糖和侧金盏花醇不发酵 产生H2S 分解NH3 IMViC 还原硝酸盐 还原美蓝 接触酶阳性 氧化酶阳性 不明胶液化4 抵抗力不强 1 易被普通的消毒药 阳光或热杀死 如 3 石炭酸 3 福尔马林 10 石灰乳 0 5 l NaOH 0 1 升汞及2 来苏儿经1 2min可被杀死 2 水浴56 15min 60 10min内被杀死 阳光曝晒10min可失活 5 抗原结构抗原结构复杂 主要有荚膜抗原和菌体抗原 1 荚膜抗原 分成A B D E四个血清群 E型 1987 Rimler和Rhoade 火鸡 2 菌体抗原 O抗原 共16个型 3 我国禽巴氏菌以5 A最多 其次是8 A 猪以5 A 6 B为主 其次是8 A和2 D 牛 羊以6 B最多 家兔以7 A为主 其次是5 A 6 致病性可引起多种畜禽巴氏杆菌病 亦称出血性败血症 不同动物的巴氏杆菌 常对该种动物呈现较强致病力 对其他动物较少引起交叉感染 常见的有 马巴氏杆菌病 猪巴氏杆菌病 猪肺疫 牛巴氏杆菌病 牛出血性败血症 羊巴氏杆菌病 家兔巴氏杆菌病 禽巴氏杆菌病 禽霍乱 鹿巴氏杆菌病 貂巴氏杆菌病 貂出血性败血症 骆驼巴氏杆菌病等 7 微生物学诊断 1 采集病料 血液 肝脏等 2 染色镜检 革兰氏染色 美兰染色等 3 分离培养 接种于鲜血琼脂 24h后 可形成淡灰色 圆形 湿润 露珠样小菌落 不溶血 革兰氏染色为阴性的短小杆菌 美兰染色两极浓染 4 生化试验 见前述 5 动物感染试验 二 溶血性巴氏杆菌 1 形态和多杀巴氏杆菌相似 呈球状或杆状 但较大 0 5 2 5 m G 无芽胞 无鞭毛 有荚膜 两极着色 2 营养要求不严格 1 普通琼脂生长良好 24h后 菌落呈圆形 光滑 湿润 半透明 2 血琼脂上 新分离菌微弱的 溶血 连续传代培养 溶血性减弱或消失 3 麦康凯上缓慢生长 3 发酵某些糖类产酸不产气 如葡 麦 蔗 半乳 果 甘露醇等 与多杀巴氏杆菌相比不产生靛基质 紫乳变酸且凝固 有些菌株产生硫化氢 4 抵抗力与多杀巴氏杆菌相似 5 按生化特性和致病力可分为两个生物型 A生物型包括1 2 5 6 7 8 9 11 12 13 14血清型 B生物型分为3 4 10 15血清型6 引起牛和绵羊的肺炎 新生羔羊败血症 三 鸭疫里默氏杆菌 Riemerellaanatipestifer 1 该菌曾称为 鸭疫巴氏杆菌 为什么 1 形态与巴氏杆菌相似 为G 有荚膜 无芽胞 不运动 两极着色 2 菌落形态也与巴氏杆菌相同 3 培养特性 在巧克力琼脂 血琼脂 胰酶大豆琼脂生长良好 但该菌培养时需要5 的CO2 4 生化特性 与败血性巴氏杆菌基本相同 由于以上等因素 把该菌称为 鸭疫巴氏杆菌 2 现在为什么称为 鸭疫里默氏杆菌 Rossau等 1991 和Segers等 1993 据DNA rRNA杂交分析 蛋白质 脂肪酸组成和表型特征 如不产生色素 产生呼吸醌 7 甲基萘醌 等 建议将该菌单独列为 里默氏杆菌属 将该菌命名为 鸭疫里默氏杆菌 3 致病性 1 可感染家鸭 火鸡和多种鸟类 2 主要发生于1 8周龄鸭 尤其是2 3周龄可大批发病 死亡 也称为传染性浆膜炎 新鸭病 鹅也可发生 称为鹅渗出性败血症 3 特征病变 纤维素性心包炎 肝周炎 气囊炎等 也可能发生无任何症状的呼吸道感染 第六节嗜血杆菌属 一 染色与形态特性1 G 小到中等大小 0 3 0 4 1 0 m 2 无芽胞 无鞭毛 新分离菌株有时能见到荚膜 单个 成对分布 有时形成丝状 表现为多形性 二 培养特性 1 酶系统不完善 培养时需加入X和V两种生长因子 血液中有两种生长因子 X因子 血红蛋白衍生物 V因子 辅酶I或辅酶II 2 需氧或兼性厌氧 初次分离时需要5 10 的CO2 3 常用巧克力培养基 呈针尖大小 光滑 透明 的露滴状菌落 边缘整齐 4 普通琼脂和鲜血琼脂生长不良 不溶血 卫星现象 在血琼脂上培养时 如同时有葡萄球菌生长 可出现葡萄球菌周围的嗜血杆菌菌落较大 离葡萄球菌越远则越小 三 生化特性 糖发酵试验 能发酵葡 麦 甘 蔗 不发酵乳 伯胶糖等 还原硝酸盐 不产生H2S 不明液化胶 不产生靛基质 氧化酶和接触酶 因不同菌株而有差异 四 抵抗力不强 1 常用消毒剂可杀灭 2 一般在60 条件下10 20min即可杀灭 3 室温下只能生存2 4d 五 致病力 嗜血杆菌属共有19个种 对人有致病性的有9种 对动物有致病性的有以下几种 1 副鸡嗜血杆菌 鸡传染性鼻炎2 鸡嗜血杆菌 鸡鼻腔卡他性炎症3 猪嗜血杆菌 流感病猪并发感染或浆膜腔 脑膜 关节的纤维素性炎症4 副猪嗜血杆菌 分离自猪体5 绵羊嗜血杆菌 绵羊肺炎或支气管肺炎6 昏睡嗜血杆菌 牛脑炎