第一章蛋白质化学基本知识VIP

第1次课 学习蛋白质化学的重要性 1 国家基础科学研究的需要 ppt1 2 国家中长期科学与技术发展战略规划研究的需要 ppt2 3 同学们将来科学研究的需要 ppt3 4 蛋白质本身的重要 后面介绍 蛋白质化学的课时安排 理论课24课时 12次 分布在1 15周 实验课8课时 2个实验 邵老师 考试第17周 2课时 合计 34课时 蛋白质化学的基本知识 第一章 基本知识提问 常见20种氨基酸的情况 分类 中文名 三字符 一字符 等电点等 2 多肽 蛋白质定性和定量分析的依据 3 多肽 蛋白质的结构及检测方法 一 什么是蛋白质 蛋白质 protein 是由许多氨基酸 aminoacids 通过肽键 peptidebond 相连形成的高分子含氮化合物 第一节蛋白质的化学概念 二 蛋白质的生物学重要性 1 蛋白质是生物体重要组成成分分布广 所有器官 组织都含有蛋白质 细胞的各个部分都含有蛋白质 含量高 蛋白质是细胞内最丰富的有机分子 占人体干重的45 某些组织含量更高 例如脾 肺及横纹肌等高达80 2 蛋白质具有重要的生物学功能 1 催化 酶 2 调节 胰岛素 3 转运 血红蛋白 4 贮存 卵清蛋白 5 运动 微管蛋白 6 结构成分 角蛋白 7 防御和进攻 抗体 8 参与细胞间信息传递 三蛋白质的分类 一 根据蛋白质分子的形状 1 球状蛋白质 globularprotein 大多数可溶性蛋白质 2 纤维状蛋白质 fibrousprotein 胶原蛋白 弹性蛋白 丝状蛋白 二 根据组成和溶解度 1 单纯蛋白质 simpleprotein 也称简单蛋白质 完全由氨基酸组成的蛋白质 单纯蛋白质的分类 根据溶解度的不同 1 清蛋白 albumin 溶于水及稀盐 稀酸或稀碱溶液 如血清清蛋白 2 球蛋白 globulin 不溶于水而溶于稀盐溶液 如血清球蛋白 3 谷蛋白 glutelin 不溶于水 醇及中性盐溶液 但溶于稀酸 稀碱 如米谷蛋白 4 谷醇溶蛋白 prolamine 不溶于水 但溶于70 80 乙醇 如玉米醇溶蛋白 6 鱼精蛋白 protamine 溶于水及稀酸溶液 分子中含碱性氨基酸特别多 呈 强 碱性 如鲑精蛋白 7 硬蛋白 scleroprotein 不溶于水 盐 稀酸 稀碱溶液 如胶原蛋白 角蛋白 丝心蛋白 弹性蛋白等 5 组蛋白 histone 溶于水及稀酸溶液 分子中含Arg Lys较多 呈 弱 碱性 如小牛胸腺组蛋白 2 缀合蛋白质 conjugatedprotein 也称结合蛋白质 由蛋白质和非蛋白质两部分组成 缀合蛋白质的分类 根据非蛋白质成分即辅基的不同 1 糖蛋白 glycoprotein 含糖类 如胶原蛋白 2 脂蛋白 lipoprotein 含脂类 如血浆脂蛋白 3 核蛋白 nucleoprotein 含核酸 如核糖体 4 磷蛋白 phosphoprotein 含磷酸 如酪蛋白 5 金属蛋白 metalloprotein 含金属 如铁蛋白含Fe 6 血红素蛋白 hemoprotein 辅基为血红素 如血红蛋白 7 黄素蛋白 flavoprotein 辅基为黄素 FAD或FMN 如琥珀酸脱氢酶 含FAD 蛋白质的化学组成TheMolecularComponentofProtein 第二节 一 组成蛋白质的元素 各种蛋白质的含氮量很接近 平均为16 由于体内的含氮物质以蛋白质为主 因此 只要测定生物样品中的含氮量 就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量 100克样品中蛋白质的含量 g 每克样品含氮克数 6 25 100 蛋白质元素组成的特点 1 16 二 氨基酸 AminoAcid 存在于自然界中的氨基酸有300余种 但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种 且均属L 氨基酸 甘氨酸除外 生物界中也有D 氨基酸 大都存在于某些细胞产生的抗生素和植物的生物碱中 哺乳动物也存在不参与蛋白质组成的游离D 氨基酸 如D 丝氨酸 D 天冬氨酸 一 组成人体的20种氨基酸均属L 氨基酸 L 氨基酸通式 R为侧链 L 型氨基酸共同特点 氨基 或脯氨酸的亚氨基 连接在与羧基相连的 碳原子上 碳原子为不对称碳原子 甘氨酸除外 不同的氨基酸其侧链R各异 二 氨基酸的分类 根据侧链的结构和理化性质可分为四类 非极性疏水性氨基酸极性中性氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸 侧链含烃链的非极性疏水性氨基酸 甘氨酸 丙氨酸 缬氨酸 亮氨酸 异亮氨酸 甲硫氨酸 脯氨酸 根据侧链结构 丙氨酸侧链的疏水性最小 甘氨酸侧链介于极性与非极性之间 甘氨酸glycineGlyG5 97 丙氨酸alanineAlaA6 00 缬氨酸valineValV5 96 亮氨酸leucineLeuL5 98 异亮氨酸isoleucineIleI6 02 苯丙氨酸phenylalaninePheF5 48 脯氨酸prolineProP6 30 结构式中文名英名 三字符号 一字符号 等电点 1 非极性疏水性氨基酸 2 侧链有极性但不带电荷的极性中性氨基酸 色氨酸 丝氨酸 酪氨酸 半胱氨酸 蛋氨酸 苏氨酸 天冬酰胺 谷氨酰胺半胱氨酸侧链的巯基失去质子的倾向较其它氨基酸大 极性最强 色氨酸tryptophanTryW5 89 丝氨酸serineSerS5 68 酪氨酸tyrosineTryY5 66 半胱氨酸cysteineCysC5 07 蛋氨酸methionineMetM5 74 天冬酰胺asparagineAsnN5 41 谷氨酰胺glutamineGlnQ5 65 苏氨酸threonineThrT5 60 2 极性中性氨基酸 天冬氨酸谷氨酸侧链均含有羧基 可解离带负电荷 赖氨酸精氨酸组氨酸分别含氨基胍基咪唑基可质子化带正电荷 3侧链含负性解离团的酸性氨基酸 4侧链含正性解离团的酸性氨基酸 天冬氨酸asparticacidAspD2 97 谷氨酸glutamicacidGluE3 22 赖氨酸lysineLysK9 74 精氨酸arginineArgR10 76 组氨酸histidineHisH7 59 3 酸性氨基酸 4 碱性氨基酸 几种特殊氨基酸 脯氨酸 亚氨基酸 亚氨基能与另一羧基形成肽键 胱氨酸 半胱氨酸 2个Cys通过脱氢后可以二硫键相结合 形成胱氨酸 二硫键 三 氨基酸的理化性质 1 两性解离及等电点 氨基酸是两性电解质 其解离程度取决于所处溶液的酸碱度 1 等电点 isoelectricpoint pI 在某一pH的溶液中 氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等 成为兼性离子 呈电中性 此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点 pH pI pH pI pH pI 氨基酸的兼性离子 阳离子 阴离子 2 等电点pI计算公式 若一个氨基酸有3个可解离基团 写出它们电离式后取兼性离子两边的pk值平均值 即为此氨基酸的pI值 氨基酸的pI是由 羧基和 氨基的解离常数的负对数决定的 对侧链R基不解离的中性氨基酸来说 pI 1 2 pk1 pk2 第2次课 2 氨基酸具有特征性的滴定曲线 3 紫外吸收 根据氨基酸的吸收光谱 含有共轭双键的色氨酸 酪氨酸的最大吸收峰在280nm附近 大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基 所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法 芳香族氨基酸的紫外吸收 4 氨基参与多种化学反应 氨基酸的 氨基的一个氢原子可被2 4二硝基氟苯 DNFB 取代 产生二硝基苯基氨基酸 可用于鉴定蛋白质N 末端氨基酸 在弱碱中 氨基酸的 氨基与其他的伯胺一样 在常温下与亚硝酸作用生成氮气 通过测定标准下生成的氮气的体积 可计算出氨基酸的量 F 5 氨基酸的 氨基与 羧基共同参与茚三酮反应 氨基酸与茚三酮水合物共热 可生成蓝紫色化合物 其最大吸收峰在570nm处 由于此吸收峰值大小与氨基酸释出的含量存在正比关系 因此可作为氨基酸定量分析方法 例外 Pro黄色 Asn棕色 二 肽 一 肽 peptide 肽 是分子间通过氨基酸相连形成的一类化合物 肽键 由二个氨基酸缩合而成的肽叫二肽 由三个氨基酸缩合而成的肽叫三肽 由几个至几十个氨基酸相连而成的肽叫寡肽 由较多的氨基酸缩合而成的叫多肽 肽键 peptidebond 是由一个氨基酸的 羧基与另一个氨基酸的 氨基脱水缩合而形成的化学键 N端 C端 氨基酸残基 多肽链可简单表示如下 氨基酸残基 肽链中的氨基酸分子因脱水缩合而基团不全 被称为氨基酸残基 N端 有自由氨基的一端C端 有自由羧基的一端 二 几种生物活性肽 1 谷胱甘肽 glutathione GSH GSH的巯基具有还原性 可作为体内重要的还原剂保护体内蛋白质和酶分子免遭氧化 使蛋白质和酶处在活性状态 谷氨酸半胱氨酸甘氨酸 GSH过氧化物酶 GSH还原酶 NADPH H NADP 在谷胱甘肽过氧化酶的催化下 GSH可还原细胞内产生的H2O2 使其变成H2O 与此同时 GSH被氧化成氧化性谷胱甘肽 GSSG 后者在谷胱甘肽还原酶催化下 再生成GSH 体内许多激素属寡肽或多肽 神经肽 neuropeptide 2 多肽类激素及神经肽 蛋白质的分子结构TheMolecularStructureofProtein 第三节 蛋白质的分子结构 一级结构 一 蛋白质的一级结构 primarystructure 定义蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序 即氨基酸的线性序列 在基因编码的蛋白质中 这种序列是由mRNA中的核苷酸序列决定的 主要化学键肽键二硫键 研究意义一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础 但并不是决定蛋白质空间构象的唯一因素 胰岛素的一级结构 1953年 由F Sanger测定 由51个氨基酸残基组成 分为A B两条链 A链21个氨基酸残基 B链30个氨基酸残基 A B两条链之间通过两个二硫键联结在一起 A链另有一个链内二硫键 二 蛋白质的二级结构 secondarystructure 定义蛋白质的二级结构指蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构 即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置 并不涉及氨基酸残基侧链的构象 主链与侧链由肽键和 碳原子构成的多肽链骨架称为主链 伸展在外的R基团称为侧链 主要形式 螺旋 折叠 转角无规则卷曲 主要化学键 氢键 参与肽键的6个原子C 1 C O N H C 2位于同一平面 C 1和C 2在平面上所处的位置为反式 trans 构型 此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元 peptideunit 一 肽单元 多肽链的主链由许多酰胺平面组成 平面之间以 碳原子相隔 而C C键和C N键是单键 可以自由旋转 其中C C键旋转的角度称 C N键旋转的角度称 和 这一对两面角决定了相邻两个酰胺平面的相对位置 也就决定了肽链的构象 二 蛋白质二级结构的主要形式 螺旋 helix 折叠 pleatedsheet 转角 turn 无规卷曲 randomcoil 螺旋 helix 螺旋结构特点 右手螺旋每3 6个氨基酸残基螺旋上升一圈 螺距为0 54nm氢键维系 形成于每个肽键的N H和第四个肽键的羰基氧之间 氨基酸侧链伸向螺旋外侧 螺旋中的全部肽键都可形成氢键 氢键的方向与螺旋长轴基本平衡 氨基酸残基侧链可影响 螺旋的形成 在多肽链中连续的出现带同种电荷的极性氨基酸 螺旋就不稳定 在多肽链中只要出现pro 螺旋就被中断 产生一个弯曲 bend 或结节 kink Gly的R基太小 难以形成 螺旋所需的两面角 所以和Pro一样也是螺旋的最大破坏者 肽链中连续出现带庞大侧链的氨基酸如Ile 由于空间位阻 也难以形成 螺旋 折叠 pleatedsheet 折叠的特点 与 螺旋结构完全不同 呈折纸状 折叠多肽链充分伸展 每个肽单元以C 为旋转点 依次折叠为锯齿状结构 氨基酸侧链交替地位于锯齿状结构上下方 在两条相邻的肽链之间形成氢链 折叠有平行和反平行的两种形式 每一个氨基酸在主轴上所占的距离 平行的是0 325nm 反平行的是0 35nm 转角 turn 和无规卷曲 转角 是多肽链180 回折部分所形成的一种二级结构 通常有4个氨基酸残基组成 其第1个残基的羰基氧 O 与第4个残基的氨基 H 可形成氢键 细胞色素C的三级结构 无规则卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构 但许多蛋白质的功能部位常常埋伏在这里 RNA酶的分子结构 螺旋 折叠 转角 无规卷曲 三 模体 motif 模体或超二级结构是1973年Rossmann提出的 它是指二级结构的基本结构单位 螺旋 折叠等 相互聚集 形成有规律的二级结构的聚集体 主要有 等 细胞色素C的 结构 细胞核抗原的 结构 纤溶酶原的 结构 钙离子结合蛋白 锌指结构 zincfinger 折叠 折叠 螺旋 与DNA相互作用 三 蛋白质的三级结构 tertiarystructure 整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置 即肽链中所有原子或基团在三维空间的排布位置 定义 主要化学键 疏水作用 离子键 氢键和范德华力等 一 三级结构 维持蛋白质构象的各种化学键 三级结构的主要特点 含多种二级结构单元 有明显的折叠层次 是紧密的球状或椭球状实体 分子表面有一空穴 活性部位 疏水侧链埋藏在分子内部亲水侧链暴露在分子表面 三级结构形成后 蛋白质分子才形成固有的分子形状 才具有亲水胶体的特性 功能蛋白质的活性部位得以形成并表现出相应的生物学活性 三级结构的重要性 肌红蛋白的三级结构 二 结构域 domain 定义 大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个结构紧密的球状或纤维状的区域 折叠得较为紧密 各行使其功能 称为结构域 最常见的结构域约含100 200个氨基酸残基 少至40个左右 多至400个以上 纤连蛋白分子的结构域 3 磷酸甘油醛脱氢酶亚基的结构域示意图 如图 有两个亚基构成的3 磷酸甘油醛脱氢酶 每个亚基由两个结构域组成 N端第1 146个氨基酸残基形成的第一个结构域能与NAD 结合 第二个结构域 第147 333氨基酸残基 能与底物3 磷酸甘油醛结合 结构域 domain 在空间上相对独立 免疫球蛋白结构域 三 分子伴侣 molecularchaperone 定义 有些蛋白质被合成以后 自己不能独立形成自由能最低的立体结构 而需要一类蛋白质来帮助折叠 这类蛋白质称为分子伴侣 它们普遍存在于真核生物和原核生物中 一般使用ATP的能量帮助其它蛋白质形成自由能最低的空间构象 分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开 如此重复进行可防止错误的聚集发生 使肽链正确折叠 分子伴侣也可与错误聚集的肽段结合 使之解聚后 再诱导其正确折叠 分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫键的正确形成起了重要的作用 分子伴侣 chaperon 通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构 四 蛋白质的四级结构 quaternarystructure 亚基之间的结合力主要是疏水作用 其次是氢键和离子键 蛋白质的四级结构 蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用 称为蛋白质的四级结构 亚基 subunit 有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链 每一条多肽链都有完整的三级结构 此多肽链就是蛋白质分子的亚基 一般来说亚基不具有生物活性 只有当这些亚基聚合成一个完整的蛋白质分子后 才具有生物活性 一 具有四级结构形式的蛋白质由多亚基组成 二 亚基通过亚基间相互作用联系在一起 以血红蛋白 hemoglobin 为例 说明蛋白质的四级结构 血红蛋白是由2个 亚基 2个 亚基组成的四聚体 两种亚基三级结构相似 每个亚基结合一个血红素辅基 个亚基以正四面体的方式排列 彼此之间以非共价键相连 主要是离子键 氢键 具有运输氧和CO2的功能 链 链 血红素 血红蛋白 从一级结构到四级结构 蛋白质结构与功能的关系TheRelationofStructureandFunctionofProtein 第四节 一 一级结构是空间构象的基础 一 蛋白质一级结构与功能的关系 核糖核胰酸酶的一级结构 天然状态 有催化活性 尿素 巯基乙醇 去除尿素 巯基乙醇 非折叠状态 无活性 S S被还原成半胱氨酸残基 二 一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构与功能 1同源蛋白 在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质 它的一级结构中有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的 称为不变残基 其他位置的氨基酸差异较大 称为可变残基 例如不同哺乳动物的胰岛素分子结构都由A和B两条链组成 且二硫键的配对和空间构象极其相似 一级结构也相似 仅有个别氨基酸有差异 因此它们都执行着相同的调节糖代谢的生理功能 哺乳动物胰岛素氨基酸序列差异 2氨基酸序列提供重要的生物化学信息 一些广泛存在于生物界的蛋白质如细胞色素C 比较它们的结构 可以帮助了解物种进化间的关系 物种越接近 则细胞色素C的一级结构越相似 其空间构象和功能也相似 例如猕猴与人类很接近 两者一级结构只相差一个氨基酸残基 即第102位氨基酸猕猴为精氨酸 人类为酪氨酸 人类和黑猩猩的细胞色素C一级结构完全相同 面包酵母与人类从物种进化来看 两者相差极远 所以两者细胞色素C一级结构相差达51个氨基酸 灰鲸是哺乳类动物 由陆上动物演化 它与猪 牛及羊只相差2个氨基酸 不同生物细胞色素C的进化树 3重要蛋白质序列的改变可引起疾病 N val his leu thr pro glu glu C 146 N val his leu thr pro val glu C 146 HbA 链 HBS 链 有些蛋白质分子中起关键作用的氨基酸残基缺失或被替代 都会严重影响空间构象乃至生理功能 如镰刀形红细胞贫血症 sicklecellanemia 二 蛋白质空间结构与功能的关系 球状蛋白质 肽链为卷曲的 螺旋肽链 链的折叠很紧密 蛋白质分了内部无空穴 肌红蛋白 血红蛋白和细胞色素c等都是研究得比较清楚的球状蛋白质 纤维状蛋白质 如丝心蛋白等的肽链则为 一折叠的伸直肽链 由于肽链折叠或构象的差异 所以形成这两类蛋白质的性质和功能的差异 一 蛋白质二级结构与功能的关系 二 肌红蛋白和血红蛋白结构 肌红蛋白 myoglobin Mb 与血红蛋白都是含有血红素辅基的蛋白质 血红素是铁卟啉化合物 由4个甲炔基相连成为一个环形 Fe2 居于环中 铁离子有6个配位键 其中4个与吡咯环的N配位结合 1个配位键和肌红蛋白的93位组氨酸残基结合 氧则与Fe2 形成第6个配位键 接近第64位 E7 组氨酸 肌红蛋白 肌红蛋白是一个只有三级结构的蛋白质 有8段 螺旋结构 分别成为ABCDEFGH肽段 整条多肽链折叠成紧密球状分子 氨基酸残基上的疏水侧链大都在分子内部 富极性及电荷的则在分子表面 因此水溶性较好 Mb分子内部有个袋形空穴 血红素居于其中 血红蛋白 血红蛋白具有四个亚基组成的四级结构 每个亚基中间有一个疏水局部 可携带一个血红素并携带一分子氧 因此1分子Hb共结合四分子氧 Hb各亚基的三级结构与Mb极为相似 Hb亚基之间通过八对盐键 使四个亚基紧密结合而形成亲水的球状蛋白 Hb与Mb一样能可逆地与O2结合 Hb与O2结合后称为氧合Hb 氧合Hb占总Hb的百分数 称百分饱和度 随O2浓度变化而改变 二 血红蛋白的构象变化与结合氧 下图为Hb和Mb的氧解离曲线 前者为S状 后者为直角双曲线 根据S曲线特征可知 Hb中第一个亚基与O2结合以后 促进第二及第三个亚基与氧气的结合 当前三个亚基与O2结合后 又大大促进第四个亚基与O2的结合 肌红蛋白 Mb 和血红蛋白 Hb 的氧解离曲线 1协同效应 cooperativity 定义 一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后 能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象 称为协同效应 如果是促进作用则称为正协同效应 positivecooperativity 如果是抑制作用则称为负协同效应 negativecooperativity 正协同效应理论 未结合O2时 Hb的 1 1和 2 2呈对角排列 结构较为紧密 称为紧张态 T态 T态Hb与O2的亲和力小 随着O2的结合 4个亚基羧基末端之间的盐键断裂 其二级 三级 四级结构也发生变化 使 1 1和 2 2的长轴形成15度的夹角 结构显得相对松弛 称为松弛态 R态 T态转变成R态是逐渐结合氧气完成的 在脱氧Hb中 Fe2 半径比卟啉环中间的孔大 因 此高出卟啉环平面0 075nm 而靠近F8位组氨酸残基 当第一个O2与血红素结合后 使Fe2 的半径变小 进入到卟啉环中间的小孔中 引起F肽段等一系列微小的移动 同时影响附近肽段的构象 造成两个亚基间盐键断裂 使亚基间结合松弛 可促进第二个亚基与O2结合 依此方式可影响第三 四个亚基与O2结合最后四个亚基全处于R态 定义 别构效应亦称变构效应 是指一个蛋白质与它的配体结合后 蛋白质的构象发生变化 使它更适合于功能的需要 这一类变化称为别构效应 2变构效应 allosterismeffect 别构蛋白 是指具有别构效应的蛋白质或酶 如血红蛋白别构剂 亦称效应剂 是指凡能触发蛋白质分子发生别构效应的物质 如O2 3影响血红蛋白氧亲和力的因素 H 和CO2促进O2的释放 波尔效应 020406080100120 80604020氧饱和百分数 Y P O2 torr 如图 H 浓度和CO2促使分压的提高 能够降低血红蛋白分子对O2的亲和力 促使氧合血红蛋白的氧解离曲线右移 这就是波尔效应 波尔效应的生理意义 当血液流经组织时 与血液相比 组织的pH值较低 CO2分压较高 因而有利于血红蛋白分子释放O2 使组织能比单纯的氧分压下降时获得更多的O2 同时 O2的释放又促进了脱氧血红蛋白分子与H 和CO2的结合 当血液流经肺部时 由于肺气泡的O2分压较高 促进脱氧血红蛋白分子释放CO2和H CO2的呼出 有利于血红蛋白的生成 BPG 2 3 二磷酸甘油酸 降低血红蛋白对O2的亲和力 BPG是红细胞中大量存在的糖代谢的中间产物 它能够降低血红蛋白对O2的亲和力 使血红蛋白的氧合曲线右移 1个脱氧血红蛋白分子能够与1分子的BPG结合 BPG降低血红蛋白氧亲和力的生理意义 当血液流经O2分压较低的组织时 红细胞中的BPG能促进氧合血红蛋白释放更多的O2 以满足组织对O2的需要 BPG的浓度越大 则O2的释放量越多 红细胞中BPG浓度的变化是调节血红蛋白分子对O2亲和力的重要因素 在空气稀薄的高山上的人 或者换气困难的肺气肿病人 其红细胞中的BPG代偿性的增加 使为数不多的氧合血红蛋白分子尽量的释放O2 以满足组织对O2的需要 三 蛋白质构象改变与疾病 蛋白质构象疾病 若蛋白质的折叠发生错误 尽管其一级结构不变 但蛋白质的构象发生改变 仍可影响其功能 严重时可导致疾病发生 蛋白质构象改变导致疾病的机理 有些蛋白质错误折叠后相互聚集 常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀 产生毒性而致病 表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变 这类疾病包括 人纹状体脊髓变性病 老年痴呆症 亨停顿舞蹈病 疯牛病等 疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白 prionprotein PrP 引起的一组人和动物神经退行性病变 正常的PrP富含 螺旋 称为PrPc PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为 折叠的PrPsc 从而致病 第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化ThePhysicalandChemicalCharactersandSeparationandPurificationofProtein 一 蛋白质的理化性质 一 蛋白质的两性电离 二 蛋白质的胶体性质 三 蛋白质的变性 沉淀和凝固 四 蛋白质的紫外吸收 五 蛋白质的呈色反应 一 蛋白质的两性电离 蛋白质是由氨基酸构成的 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外 氨基酸残基侧链中某些基团 在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团 蛋白质的等电点 pI 概念 当蛋白质溶液处于某一pH时 蛋白质解离成正 负离子的趋势相等 即成为兼性离子 净电荷为零 此时溶液的pH称为蛋白质的等电点 pI是蛋白质的特征性常数 pH pI 带负电荷 pH pI带正电荷 体内多数蛋白pI为5 0左右 在人体体液为pH7 45环境下 多数蛋白带负电荷 利用蛋白质两性电离的性质 可通过电泳 离子交换层析 等电聚焦等技术分离蛋白质 二 蛋白质的胶体性质 颗粒大小 在1 100nm之间 胶体 因此溶于水 成为亲水胶体 稳定亲水胶体的因素 水化膜表面电荷 由于胶体溶液中的Pr不能通过半透膜 因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去 水化膜 溶液中蛋白质的聚沉 三 蛋白质的变性 沉淀和凝固 变性 menstruation 概念 在某些理化因素作用下 蛋白质分子的特定空间构象被破坏 从而导致理化性质的改变和生物活性的丧失 变性因素 化学因素 胍 脲 有机溶剂 强酸强碱 巯基乙醇 重金属离子 生物碱试剂 物理因素 加热 加压 超声波 紫外线 变性本质 二硫键和非共价键的破坏引起空间结构的改变 不涉及一级结构的改变 蛋白质变性后理化性质和物理性质的改变 溶解度降低粘度增加结晶能力消失生物活性丧失易被蛋白酶水解 应用举例 临床医学上 变性因素常被应用来消毒及灭菌 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂 如疫苗等 的必要条件 复性 renaturation 若蛋白质变性程度较轻 去除变性因素后 蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能 称为复性 蛋白质沉淀 proteinprecipitation 在一定条件下 蛋白疏水侧链暴露在外 肽链融会相互缠绕继而聚集 因而从溶液中析出 这一现象被称为蛋白质沉淀 变性的蛋白质易于沉淀 有时蛋白质发生沉淀 但并不变性 蛋白质的凝固作用 proteincoagulation 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块 此凝块不易再溶于强酸和强碱中 这种现象称为蛋白质的凝固作用 四 蛋白质的紫外吸收 由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸 因此在280nm波长处有特征性吸收峰 蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系 因此可作蛋白质定量测定 蛋白质浓度mg ml 1 45A280 0 74A260 五 蛋白质的呈色反应 茚三酮反应 ninhydrinreaction 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应 生成蓝紫色化合物 双缩脲反应 biuretreaction 蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热 呈现紫色或红色 此反应称为双缩脲反应 双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度 其它呈色反应 反应试剂颜色反应基团有此反应的Pr及AAMillon反应硝酸 亚硝酸红色酚基Tyr黄色反应HNO3及NH3黄 橘黄苯基Phe Tyr乙醛酸反应乙醛酸 H2SO4紫红吲哚Trp坂口反应次氯酸钠 萘酚红色胍基ArgFolin酚试剂反应CuSO4 磷钨酸 钼酸兰色酚基Tyr 二蛋白质的分离纯化 一 蛋白质分离纯化的一般原则 二 根据蛋白质分子大小的差异分离 三 根据蛋白质的溶解度差异分离 四 根据蛋白质的荷电差异分离 五 利用生物分子专一性结合的特性分离 一 蛋白质的分离纯化的一般程序 目标 增加制品的纯度或比活 以增加单位蛋白质重量中所需要的蛋白质重量和生物活性 一般程序 前处理 选材 破碎 混合物的分离 粗分级分离细分级分离结晶 二 根据蛋白质分子大小的差异分离 透析及超滤法 透析 dialysis 利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法 只用于除盐类和小分子杂质 超过滤 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜 达到浓缩蛋白质溶液的目的 除小分子杂质 分离 浓缩蛋白质 加压 蛋白质溶液 半透膜 超滤液 支持膜的栅板 密度梯度离心 蛋白质颗粒沉降不仅决定于它的大小 也决定于它的密度 若它在具有密度梯度的介质中离心时 质量和密度大的颗粒沉降的较快 每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度时 即停止不前 凝胶过滤法原理 也称分子排阻层析 层析柱内填满带有小孔的颗粒 一般由葡聚糖制成 蛋白质溶液加于柱顶部 任其往下渗漏 小分子蛋白质进入孔内 因而在柱中滞留时间较长 大分子不能进入孔内而径直流出 因此不同大小的蛋白质得以分离 分子筛 具有三维空间网状结构的物质 有天然的 也可人工合成 常用分子筛葡聚糖凝胶 Sephadex 琼脂糖凝胶瑞典Sepharose 美国Bio Gel聚丙烯酰胺凝胶 三 根据蛋白质的溶解度差异分离 盐析法 原理 是将硫酸铵 硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液 使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏 导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素被去除沉淀 优点 沉淀的蛋白质保持着它的天然构象 能再溶解 有机溶剂分级分离法 原理 是将有机溶剂 丙酮 乙醇 加入蛋白质溶液中 导致溶液介电常数降低 增加了相反电荷之间的吸引力 蛋白质分子表面可解离基的离子化强度减弱 水化程度降低 因此促进了蛋白质分子的聚集和沉淀 注意事项 使用丙酮沉淀时 必须在0 4 下进行 蛋白质被丙酮沉淀后 应立即分离 防止变性 四 根据蛋白质的荷电差异分离 电泳 electrophoresis 定义 蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒 在电场中能向正极或负极移动 这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术 称为电泳 根据支撑物的不同 可分为薄膜电泳 凝胶电泳等 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 常用于蛋白质分子量的测定 等电聚焦电泳 通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法 双向凝胶电泳 是蛋白质组学研究的重要技术 几种重要的蛋白质电泳 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 在蛋白质样品和聚丙烯酰胺凝胶系统中加入带负电荷较多的十二烷基磺酸钠 SDS 使所有蛋白质颗粒表面覆盖有一层SDS分子 导致蛋白质分子间的电荷差异消失 此时蛋白质在电场中的泳动速率仅与蛋白质颗粒大小有关 常用于蛋白质分子量的测定 SDS的作用 由于SDS是阴离子 使多肽表面覆盖的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量 消除了原来的电荷差异 SDS是变性剂 它能破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用 巯基乙醇打开二硫键 因此使蛋白质分子处于伸展状态 改变了蛋白质单体分子的构象 不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都相同 长轴长度随其分子量的大小成正比变化 等电聚焦电泳 在聚丙烯酰胺凝胶中加入系列两性电解质载体 在电场中形成一个连续而稳定的线性pH梯度 也即pH从凝胶的正极向负极依次递增 电泳时被分离蛋白质处在偏离其等电点的pH位置时带有电荷而移动 至该蛋白质PI值相等的pH区域时 其静电荷为零而不再移动 这种通过蛋白质的等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法称为等电聚焦电泳 双向凝胶电泳 第一向为蛋白质等电聚焦电泳 第二项为SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 通过被分离蛋白质等电点和分子量的差异 将复杂蛋白质混合物在二维平面上分离 离子交换层析 chromatography 定义 利用离子交换树脂作为支持物 将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法 分类 阳离子交换树脂 活性基团是酸性的 如羧甲基纤维素等 阴离子交换树脂 活性基团是碱性的 如二乙基氨基乙基纤维素 五 利用生物分子专一性结合的特性 亲和层析分离 第3次课 实验安排 亲和层析 affinitychromatography 定义 利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力 原理 把待纯化的某一蛋白质的特异配体通过适当的化学反应共价的连接到像琼脂糖凝胶一类表面的功能基 当蛋白质混合物加到填有亲和介质的层析柱时 待纯化的某一蛋白质则被吸附在含配体的琼脂糖颗粒表面上时 而其它的蛋白质则因对该配体无特异的结合部位而不被吸附 它们通过洗涤可除去 被特异结合蛋白质可用含游离的相应配体溶液把它从柱上洗脱下来 亲和层析 第六节蛋白质结构的研究方法 分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成 测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基 把肽链水解成片段 分别进行分析 测定各肽段的氨基酸排列顺序 一般采用Edman降解法 一般需用数种水解法 并分析出各肽段中的氨基酸顺序 然后经过组合排列对比 最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果 一 蛋白质一级结构的研究方法 一 氨基酸组成分析 测定蛋白质的氨基酸组成首先要通过酸水解破坏蛋白质的肽键 典型酸水解的条件是 真空条件下 110 用6M盐酸水解16至72h 然后水解的混合物 水解液 进行柱层析 通过柱层析可以将水解液中的每一种氨基酸分离出来并进行定量 这一过程称为氨基酸分析 aminoacidanalysis 二 蛋白被水解成肽段 要测定较大蛋白质的氨基酸序列 需要将其降解为一些肽段 经HPLC分离出各个肽段 蛋白质降解常用的是一些水解酶 如胰蛋白酶 和化学试剂 如溴化氰 一般都是采用两种酶 或化学试剂 解获得两组不同的肽段 以便最后拼出完整的氨基酸序列 胰蛋白酶特异地催化赖氨酸残基和精氨酸残基羧基侧的肽键的水解 而胰凝乳蛋白酶特异地催化苯丙氨酸 酪氨酸和色氨酸三种芳香族氨基酸残基羧基一侧的肽键水解 三 氨基酸序列测定 1950年P Edman公布了一项新的氨基酸序列的测定技术 即运用苯异硫氰酸酯与氨基酸的反应 Edman反应 这种技术每次都只是从蛋白质的N端解离和鉴定一个氨基酸残基 这是一项使蛋白质序列分析革命化的技术 1967年Edman和Begg建成了多肽氨基酸序列分析仪 二 通过核酸来演绎蛋白质中的氨基酸序列 按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列 分离编码蛋白质的基因 测定DNA序列 排列出mRNA序列 蛋白质的氨基酸顺序是从信使RNA中核苷酸序列翻译过来的 因此必须先测出相应的mRNA顺序 二蛋白质空