药物分析第11章抗生素类药物分析

第十一章 抗生素类药物的分析 抗生素是指由微生物所产生 极微量即具有选择性地抑制或杀灭其他微生物的一类有机化合物 一 抗生素药物的特点 抗生素在低微浓度下即可对某些生物的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称 第一节概述 1 生物合成 发酵 2 化学合成或半合成 抗生素药物具有选择性地抑制或杀灭其他微生物作用的药物 控制抗生素质量的复杂性 分子结构多不稳定 发酵过程不易控制 生产工艺复杂 稳定性差 发酵液中含有各种无机盐 脂肪 蛋白质 降解产物 色素 热原 毒性物质 发酵过程易受污染 易降解疗效 失效毒副作用 二 抗生素药物的质量分析 一 鉴别试验 1 理化法 2 生物学法 1 化学法 2 仪器法 例青霉素钠Ch P 2000 鉴别 1 取本品与已知含量的青霉素适量 分别加水制成每1ml中约含50mg的溶液 各取1ml 加入不少于200单位的青霉素酶溶液1ml 在37 灭活1小时后 取灭菌滤纸片 分别用上述溶液浸湿后 用滤纸吸去多余的液体 置摊布金黄色葡萄球菌 CMCC B 26003 的培养基上 在37 培养约16小时后均无抑菌作用 而用同一方法检查未经青霉素酶灭活的溶液均有抑菌作用 二 检查一般杂质 特殊杂质 常增加 安全性检查 检查 异常毒性热原细菌内毒素降压物质无菌 例盐酸四环素Ch P 2005 检查 酸度溶液的澄清度有关物质干燥失重杂质吸光度热原无菌 三 含量测定 1 生物学方法 以生物学方法或生化方法测定生理活性物质 并按效价单位 IU 计算的测定方法 抗生素微生物检定法 抗生素微生物检定法 以抗生素抑制微生物生长或杀死微生物的能力作为衡量效价的标准 例磺苄西林钠Ch P 2005 含量测定 精密称取本品适量 用灭菌水制成每1ml中约含1000单位的溶液 照抗生素微生物检定法 附录 A 测定 1000磺苄西林单位相当于1mg的C16H18N2O7S2 例抗生素 含量测定 Ch P 2005 抗生素微生物检定法 附录 A 红霉素 两性霉素B 杆菌肽 硫酸多黏菌素B 硫酸庆大霉素 硫酸阿米卡星 硫酸卷曲霉素 硫酸核糖霉素 硫酸链霉素 磺苄西林钠原料及制剂 微生物检定法 优点 与临床效果一致 灵敏度高 干扰物质少 可用于未知药物 缺点 操作繁琐 耗时 准确度 精密度差 以理化方法测定主药含量 按有效物质的质量计算的测定方法 优点 准确度高 简便快速 缺点 不一定代表生物效价 易受杂质干扰 仅用于己知药物 2 理化方法 Ch P 2005 含量测定 青霉素类滴定法UVHPLC法微生物检定法 头孢菌素类HPLC法 汞量法碘量法 三 抗生素的分类 第二节 内酰胺类抗生素 青霉素类青霉素钠 钾 氨苄西林 钠 阿莫西林 钠 普鲁卡因青霉素 头孢菌素类头孢氨苄头孢羟氨苄头孢拉啶头孢噻吩钠 青霉素类 头孢菌素类 一 结构与性质 一 结构 青霉素类 头孢菌素类 青霉素类母核 青霉素G 苄青霉素 青霉素钾 lidocainehydrochloride 青霉素钠 Benzylpenicillinsodium 氨苄西林 氨苄青霉素 ampicillin 阿莫西林 羟氨苄青霉素 amoxicillin 普鲁卡因青霉素 procainebenzylpenicillin 磺苄西林钠 sulbenicillinsodium 头孢菌素类母核 头孢氨苄 cefalexin 头孢羟氨苄 cefadroxil 头孢拉定 cefradine 头孢噻吩钠 cefalotin 二 性质 与碱金属成盐易溶于水 pKa 2 5 2 8 1 酸性 羧基 与有机碱成盐难溶于水 青霉素 溶解性 2 旋光性 5 头孢唑啉钠溶液 18 24 手性C 3 UV 共轭体系 4 不稳定性 水溶液不稳定 易开环失效 干燥纯净较稳定 内酰胺环 温度 氧化剂 头孢噻吩钠水溶液25 24h失活8 青霉素钠水溶液30 24h失活56 Cu2 Pb2 Hg2 Ag 青霉素的降解反应 不同pH条件下青霉素钠降解情况 24 0 41 4129233621812531 29 31 4 半衰期 h 234567891011 pH 温度对青霉素钠稳定性的影响 pH2 30 二 鉴别试验 一 呈色反应 1 羟肟酸铁反应内酰胺 OH 例磺苄西林钠Ch P 2005 鉴别 1 取本品约20mg 加水15ml溶解后 加盐酸羟胺试液与氢氧化钠试液各2ml 放置5分钟后 加盐酸溶液 1 100 3ml与三氯化铁试液1ml 随即振摇 即显赤褐色 例头孢哌酮Ch P 2005 鉴别 1 取本品约10mg 加水2ml与盐酸羟胺溶液 取34 8 盐酸羟胺1份 醋酸钠 氢氧化钠溶液 取醋酸钠10 3g与氢氧化钠86 5g 加水溶解使成1000ml 1份 乙醇4份 混匀 3ml 振摇溶解后 放置5分钟 加酸性硫酸铁铵试液1ml 摇匀 显红棕色 2 类似肽键的反应 双缩脲反应 紫色 开环 H 例阿莫西林Ch P 1995 鉴别 2 取本品约10mg 加水6ml溶解后 加碱性酒石酸铜试液0 5ml 即显紫色 茚三酮反应 例阿莫西林Ch P 2000 鉴别 4 TLC法对照品法显色剂0 3 茚三酮 乙醇溶液 90 加热15分钟 3 其他呈色反应 与重氮苯磺酸盐反应 与变色酸 硫酸反应 H2SO4 HNO3反应 与铜盐反应 1 K Na 的火焰反应 附录 二 各种盐的反应 例青霉素钠Ch P 2005 鉴别 4 本品显钠盐的火焰反应 附录 例青霉素钾Ch P 2005 鉴别 3 本品显钾盐的火焰反应 附录 2 重氮化 偶合反应 芳香第一胺类反应 普鲁卡因青霉素 例普鲁卡因青霉素Ch P 2000 鉴别 3 本品显芳香第一胺类的鉴别反应 附录 3 沉淀反应 碱金属盐 例青霉素钠青霉素钾Ch P 2000 鉴别 2 取本品约0 1g 加水5ml溶解后 加稀盐酸2滴 即生成白色沉淀 此沉淀能在乙醇 醋酸戊酯 氯仿 乙醚或过量的盐酸中溶解 三 光谱法 1 IR法 内酰胺环上的羰基伸缩振动增强而向高波数方向位移 例青霉素钠Ch P 2005 鉴别 2 本品的红外光吸收图谱应与对照的图谱 光谱集222图 一致 例青霉素钾Ch P 2005 鉴别 2 本品的红外光吸收图谱应与对照的图谱 光谱集223图 一致 2 UV Vis法 青霉素V钾268 2741 20 1 25 头孢唑林钠272264 292 头孢氨苄262220 245 头孢噻肟钠262400 440 Cu2 四 色谱法 1 TLC法 2 HPLC法 对照品法 比较Rf和斑点颜色 比较tR 例头孢拉定Ch P 2005 鉴别 1 取本品与头孢拉定对照品适量 分别加水溶解并稀释制成每1ml中约含6mg的溶液 作为供试品溶液和对照品溶液 照薄层色谱法 附录 B 试验 吸取上述两种溶液各5 l 分别点于同一硅胶G薄层板上 以0 1mol L枸橼酸溶液 0 2mol L磷酸氢二钠溶液 丙酮 60 40 1 5 为展开剂 展开 于105 加热15分钟后 检视 供试品溶液所显主斑点的颜色与位置应与对照品溶液所显主斑点的颜色与位置相同 例头孢拉定Ch P 2005 鉴别 2 在含量测定项下记录的色谱图中 供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致 例头孢氨苄Ch P 2005 鉴别 1 在含量测定项下记录的色谱图中 供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致 2 本品的红外光吸收图谱应与对照的图谱 光谱集1090图 一致 五 微生物检定法 例青霉素钠Ch P 2000 鉴别 1 取本品与已知含量的青霉素适量 分别加水制成每1ml中约含50 g的溶液 各取1ml 加入不少于200单位的青霉素酶溶液1ml 在37 灭活1小时后 取灭菌滤纸片 分别用上述溶液浸湿后 用滤纸吸去多余的液体 置摊布金色黄色葡萄球菌 CMCC B 26003 的培养基上 在37 培养约16小时后均无抑菌作用 而用同一方法检查未经青霉素酶灭活的溶液均有抑菌作用 对照品对照法 三 特殊杂质的检查 高分子聚合物 吸光度杂质 有关物质 异构体 例青霉素钠 检查 青霉素聚合物 例青霉素钾 检查 青霉素聚合物 例阿莫西林 检查 阿莫西林聚合物 青霉噻唑蛋白 青霉素 青霉噻唑多肽类 例头孢他啶 检查 头孢他啶聚合物 例头孢曲松钠 检查 头孢曲松聚合物 例头孢哌酮钠 检查 头孢哌酮聚合物 例青霉素钠Ch P 2005 检查 青霉素聚合物照分子排阻色谱法 附录 H 测定 填充剂葡聚糖凝胶G 10 40 120 m 流动相A0 1mol L磷酸盐缓冲液 pH7 0 0 1mol LNa2HPO4 0 1mol LNaH2PO4 61 39 流动相B水流速1 5ml min检测波长254nm 例头孢他啶Ch P 2005 检查 头孢他啶聚合物照分子排阻色谱法 附录 H 测定 填充剂葡聚糖凝胶G 10 40 120 m 流动相A含3 5 硫酸铵0 1mol L磷酸盐缓冲液 pH7 0 0 1mol LNa2HPO4 0 1mol LNaH2PO4 61 39 流动相B水流速0 8ml min检测波长254nm 例头孢呋辛酯中异构体检查 例头孢氨苄中 有关物质 的检查 例青霉素钠Ch P 2005 检查 吸光度取本品 加水制成每1ml中含1 80mg的溶液 照紫外 可见分光光度法 附录 A 在280nm的波长处测定吸光度 不得大于0 10 在264nm的波长处有最大吸收 吸光度应为0 80 0 88 内酰胺类不直接与碘反应 内酰胺类碱水解产物可与碘发生定量反应 1 原理 一 碘量法 剩余碘量法 四 含量测定 例注射用普鲁卡因青霉素Ch P 2000 含量测定 取装量差异项下的内容物 精密称取约0 12g 置100ml量瓶中 加水使溶解并稀释至刻度 摇匀 精密量取5ml 置碘瓶中 加1mol L氢氧化钠溶液1ml放置20分钟 再加1mol L盐酸溶液1ml与醋酸 醋酸钠缓冲液 pH4 5 5ml 精密加入碘滴定液 0 01mol L 15ml 密塞 摇匀 在20 25 暗处放置20分钟 用硫代硫酸钠滴定液 0 01mol L 滴定 近终点时加淀粉指示液 继续滴定并强力振摇 至蓝色消失 另精密量取供试品溶液5ml 置碘瓶中 加醋酸 醋酸钠缓冲液 pH4 5 5ml 精密加入碘滴定液 0 01mol L 15ml 密塞 摇匀 在暗处放置20分钟 用硫代硫酸钠滴定液 0 01mol L 滴定 作为空白 同时用青霉素钠对照品同法测定作对照 算出供试品的含量 2 讨论 酸 Na2S2O3 SO2 S 1 弱酸性环境 pH4 5 普鲁卡因与碘在酸性条件下会产生复盐 碱 2 温度 24 26 温度 未水解的供试品亦消耗碘 3 氧气的干扰 碘瓶 4 反应时间 长时间放置使空气氧化作用加强 20 反应20 后 耗碘量随时间的变化较小 可减小测定误差 5 空白试验 A 消除样品已降解产物的干扰B 消除样品中其他消耗碘的杂质的干扰C 消除碘挥发造成的误差 以未经水解的样品作空白测定 6 采用对照品平行测定 A 可消除温度 pH 操作 环境等条件的影响B 使本法测定结果与微生物检定法一致 例注射用普鲁卡因青霉素Ch P 2000 含量测定 取装量差异项下的内容物 精密称取约0 12g 置100ml量瓶中 加水使溶解并稀释至刻度 摇匀 精密量取5ml 置碘瓶中 加1mol L氢氧化钠溶液1ml放置20分钟 再加1mol L盐酸溶液1ml与醋酸 醋酸钠缓冲液 pH4 5 5ml 精密加入碘滴定液 0 01mol L 15ml 密塞 摇匀 在20 25 暗处放置20分钟 用硫代硫酸钠滴定液 0 01mol L 滴定 近终点时加淀粉指示液 继续滴定并强力振摇 至蓝色消失 另精密量取供试品溶液5ml 置碘瓶中 加醋酸 醋酸钠缓冲液 pH4 5 5ml 精密加入碘滴定液 0 01mol L 15ml 密塞 摇匀 在暗处放置20分钟 用硫代硫酸钠滴定液 0 01mol L 滴定 作为空白 同时用青霉素钠对照品同法测定作对照 算出供试品的含量 二 电位配位滴定法 汞量法 内酰胺类不直接与汞盐反应 内酰胺类水解产物可与汞盐发生定量反应 1 原理 Ch P 2000 青霉素钾青霉素钠苯唑西林钠普鲁卡因青霉素氯唑西林钠 青霉胺与硝酸汞发生络合反应 先按2分子青霉胺与1分子汞离子的比例络合 发生第一次滴定突跃 但突跃范围很小 变化比较平缓 不宜用于做终点 继续用硝酸汞滴定时 青霉胺分子与汞离子按1 1的比例络合 生成稳定的络合物 青霉胺络汞 发生第二次滴定突跃 其突跃范围较大 变化较急剧 宜于确定终点 2 方法 醋酸盐缓冲液 滴定 水解 pH4 6 3 讨论 1 电位法指示终点 以第二次滴定突跃为终点反应摩尔比1 1 2 空白试验用未降解样品测定 3 优点不需标准品 例青霉素钠Ch P 2000 含量测定 取本品约50mg 精密称定 加水5ml溶解后 加1mol L氢氧化钠溶液5ml 摇匀 放置15分钟 加1mol L硝酸溶液5ml 醋酸盐缓冲液 pH4 6 20ml及水20ml 摇匀 照电位滴定法 附录 A 用铂电极为指示电极 汞 硫酸亚汞电极为参比电极 在35 40 用硝酸汞滴定液 0 02mol L 缓慢滴定 控制滴定过程约为15分钟 不计第一个等当点 计算第二个等当点时消耗滴定液的量 每1ml硝酸汞滴定液 0 02mol L 相当于7 128mg的总青霉素 按C16H17N2NaO4S计算 另取本品约0 5g 精密称定 加水与上述醋酸盐缓冲液各25ml 振摇使完全溶解 在室温下 立即用硝酸汞滴定液 0 02mol L 滴定 滴定终点判断方法同上 每1ml硝酸汞滴定液 0 02mol L 相当于7 128mg的降解物 按C16H17N2NaO4S计算 每1mg的C16H17N2NaO4S相当于1670青霉素单位 1 硫醇汞盐法 降解 咪唑 1 原理 催化剂 青霉素族 三 紫外 分光光度法 咪唑 降解 2 讨论 1 咪唑催化的降解率高 且硫醇汞盐稳定 3h 2 侧链有 NH2时 需加醋酐先将其乙酰化后才能发生上述反应 pH9 咪唑 例青霉素V钾片Ch P 2000 含量测定 取本品10片 如为糖衣片则除去糖衣 精密称定 研细 精密称取适量 约相当于青霉素V0 15g 置250ml量瓶中 加水150ml 振摇使溶解 加水稀释至刻度 摇匀 滤过 精密量取续滤液5ml 置100ml量瓶中 加水稀释至刻度 摇匀 再精密量取5ml 置25ml量瓶中 加咪唑溶液至刻度 摇匀 置60 水浴中加热30分钟 取出放冷至室温 照分光光度法 附录 A 在325nm的波长处测定吸收度 另取青霉素V对照品 同法测定 计算 青霉素V钾C16H17N2O5SK388 48576 青霉素VC16H18N2O5S350 39964 水解 2 酸水解 铜盐法 JP 青霉素族 螯合物 不稳定 max320 360nm 稳定剂 3 羟肟酸比色法 USPJP 内酰胺类 NaOH 红棕色 H 四 RP HPLC法 特点快速高效灵敏度高专属性强重现性好一法多用 鉴别 检查 含测 Ch P 例头孢克洛Ch P 2005 含量测定 填充剂C18流动相磷酸二氢钾溶液 pH3 4 乙腈 92 8 检测波长254nm对照品头孢克洛 头孢克洛 3 异构体 两者分离度应大于1 5 例头孢他啶 鉴别 检查 头孢他啶聚合物 含量测定 托西酸舒他西林 鉴别 检查 有关物质 含量测定 阿莫西林 鉴别 检查 有关物质 阿莫西林聚合物 含量测定 五 生物样品中 内酰胺类抗生素的分析 色谱法 微生物法 放射免疫法 例HPLC法测定人血浆中阿莫西林填充剂YWGC18流动相0 033mol L磷酸缓冲液 pH7 2 甲醇 85 15 检测波长229nm对照品阿莫西林内标替硝唑除蛋白HClO4 第三节氨基糖苷类抗生素 一 结构与性质 一 结构 链霉素 streptomycin 巴龙霉素 paromomycin 庆大霉素 gentamycin C复合物 庆大霉素C复合物庆大霉素C1R1 R2 CH3R3 H庆大霉素C2R1 CH3R2 R3 H庆大霉素C1aR1 R2 R3 H庆大霉素C2aR1 R2 HR3 CH3 奈替米星 netilmicin 2 性质 1 溶解性与碱性 巴龙霉素 链霉素 庆大霉素 奈替米星 2 旋光性手性C 3 稳定性 链霉素pH5 7 5稳定 OH 反应 4 UV 链霉素 max 230nm 一 茚三酮反应 氨基醇 羟基胺类 二 鉴别试验 水合茚三酮 例硫酸庆大霉素Ch P 2005 鉴别 1 取本品约5mg 加水溶解后 加0 1 茚三酮的水饱和正丁醇溶液1ml与吡啶0 5ml 在水浴中加热5分钟 即显紫蓝色 二 Molisch反应 水解 或蒽酮 例硫酸卡那霉素Ch P 2005 鉴别 1 取本品约1mg 加水2ml溶解后 加0 2 蒽酮的硫酸溶液4ml 在水浴中加热15分钟 冷却 即显蓝紫色 三 N 甲基葡萄糖胺反应 Elson Morgan反应 水解 链霉素庆大霉素奈替米星 N 甲基葡萄糖胺反应 例硫酸新霉素Ch P 2005 鉴别 1 取本品约10mg 加水1ml溶解后 加盐酸溶液 9 100 2ml 在水浴中加热10分钟 加8 氢氧化钠溶液2ml与2 乙酰丙酮水溶液1ml 置水浴中加热5分钟 冷却后 加对二甲氨基苯甲醛试液1ml 即显樱桃红色 四 麦芽酚反应 链霉素特征反应 Maltol反应 麦芽酚反应 例硫酸链霉素Ch P 2005 鉴别 2 取本品约20mg 加水5ml溶解后 加氢氧化钠试液0 3ml 置水浴上加热5分钟 加硫酸铁铵溶液 取硫酸铁铵0 1g 加0 5mol L硫酸溶液5ml使溶解 0 5ml 即显紫红色 五 坂口反应 链霉胍特征反应 水解 Sakaguchi反应 次溴酸钠 坂口反应 OH 例硫酸链霉素Ch P 2005 鉴别 1 取本品约0 5mg 加水4ml溶解后 加氢氧化钠试液2 5ml与0 1 8 羟基喹啉的乙醇溶液1ml 放冷至约15 加次溴酸钠试液3滴 即显橙红色 六 反应 例 鉴别 显硫酸盐的鉴别反应Ch P 2005 硫酸新霉素硫酸链霉素硫酸核糖霉素硫酸依替米星硫酸奈替米星硫酸阿米卡星硫酸庆大霉素硫酸西索米星硫酸卡那霉素硫酸巴龙霉素硫酸小诺霉素 七 色谱法 TLC HPLC法 例 鉴别 HPLC法Ch P 2005 硫酸依替米星硫酸卡那霉素硫酸小诺霉素硫酸奈替米星硫酸阿米卡星硫酸庆大霉素硫酸西索米星硫酸巴龙霉素妥布霉素 例硫酸小诺霉素Ch P 2005 鉴别 3 HPLC法 检查 小诺霉素组分HPLC法 例硫酸依替米星Ch P 2005 鉴别 2 HPLC法 含量测定 HPLC法 例硫酸卡那霉素Ch P 2005 鉴别 2 HPLC法 含量测定 HPLC法 例 鉴别 TLC法Ch P 2005 硫酸依替米星硫酸奈替米星硫酸阿米卡星硫酸庆大霉素硫酸西索米星硫酸巴龙霉素硫酸小诺霉素妥布霉素 八 光谱法 IR法 例 鉴别 红外光吸收图谱Ch P 2005 盐酸大观霉素 光谱集1007图 硫酸新霉素 光谱集492图 硫酸链霉素 光谱集491图 硫酸阿米卡星 光谱集1079图 硫酸庆大霉素 光谱集485图 硫酸卡那霉素 光谱集484图 硫酸巴龙霉素 光谱集483图 三 特殊杂质检查及组分分析 一 链霉素中链霉素B的检查 甘露糖链霉素 3 方法TLC 1 来源发酵时菌种产生 2 效价链霉素的20 25 甘露糖对照品法 例硫酸链霉素Ch P 2005 检查 链霉素B取本品0 25mg 精密称定 置回流瓶中 加入5ml新鲜配置的硫酸 甲醇溶液 3 97 溶解 加热回流1小时 冷却 用甲醇冲洗冷凝管 合并冲洗液 并用甲醇定量稀释成每1ml中含10mg的溶液 作为供试品溶液 精密称取甘露糖对照品约36mg 置回流瓶中 同法处理后定量制成每1ml中含72 g的溶液 作为对照溶液 取上述两种溶液各10 l 分别点于同一硅胶G薄层板上以甲苯 醋酸 甲醇 50 25 25 为展开剂 展开 晾干 喷以新鲜配制的显色剂 取0 2 1 3 萘二酚乙醇溶液与20 硫酸溶液等等体积混合 即得 在110 加热数分钟显色 供试品溶液所显链霉素B斑点的颜色与对照溶液的主斑点比较 不得更深 3 0 二 硫酸奈替米星中有关物质检查 西索米星及其他未知杂质 3 显色剂茚三酮 1 来源原料引入 2 标准品溶液 1 1 5mg ml奈替米星标准品 2 3mg ml奈替米星标准品 3 西索米星标准品 1 1 2 庆大霉素C1 C2 C1a 规定各组分的相对百分含量 Ch P BPUSP JPHPLC法 三 庆大霉素C组分测定 庆大霉素本身无紫外吸收 可衍生化 1 烷基硫代 2 烷基异吲哚衍生物 例硫酸庆大霉素Ch P 2005 检查 庆大霉素C组分照高效液相色谱法 附录 D 测定 填充剂十八烷基硅烷键合硅胶流动相0 2mol L三氟醋酸 甲醇 92 8 检测器蒸发光检测器检测波长330nm标准品庆大霉素 小诺霉素 测定法取小诺霉素标准品适量 精密称定 分别用流动相制成每1ml中约含小诺霉素0 2mg 0 5mg和1 0mg的溶液作为标准溶液 1 2 3 取上述三种溶液各20ml 分别注入液相色谱仪 记录色谱图 计算标准品溶液浓度的对数值与相应的主峰面积对数值的回归方程 相关系数 r 应不小于0 99 另取本品适量 精密称定 用流动相制成每1ml中约含庆大霉素2 5mg的溶液 同法测定 用回归方程计算供试品中对应各组分的量 XCx 并根据所得的各组分的量 XCx 按下面公式计算出各组分的含量 Ch P 2005 规定C125 50 C1a15 40 C2a C220 50 四 硫酸盐测定 剩余滴定法 例硫酸奈替米星Ch P 2005 检查 硫酸盐取本品约0 12g 精密称定 加水100ml使溶解 用浓氨溶液调节pH值至11后 精密加氯化钡滴定液 0 1mol L 10ml 酞紫指示液5滴 用乙二胺四醋酸二钠滴定液 0 05mol L 滴定 注意保持滴定过程中的pH值为11 滴定至紫色开始消褪 加入乙醇50ml 继续滴定 至蓝紫色消失 并将滴定的结果用空白试验校正 每1ml氯化钡滴定液 0 1mol L 相当于9 606mg硫酸盐 SO4 本品含硫酸盐的量按无水物计算应为31 5 35 0 微生物检定法 四 含量测定 微生物检定法 HPLC法 例硫酸链霉素Ch P 2005 含量测定 精密称取本品适量 加灭菌水定量制成每1ml中约含1000单位的溶液 照抗生素微生物检定法 附录 A 测定 1000链霉素单位相当于1mgC21H38N7O12 例硫酸庆大霉素Ch P 2005 含量测定 精密称取本品适量 加灭菌水定量制成每1ml中含1000单位的溶液 照抗生素微生物检定法 附录 A 测定 可信限率不得大于7 1000庆大霉素单位相当于1mg庆大霉素 例 含量测定 Ch P 2005 微生物检定法盐酸大观霉素 硫酸新霉素 硫酸链霉素 硫酸核糖霉素 硫酸奈替米星 硫酸阿米卡星 硫酸庆大霉素 硫酸西索米星 硫酸巴龙霉素 硫酸小诺霉素HPLC法硫酸依替米星 硫酸卡那霉素 第四节四环素类抗生素 碳原子编号 四环素 TC tetracycline 金霉素 CTC chlortetracycline 氯四环素 土霉素 OTC oxytetracycline 氧四环素 多西环素 DOTC doxycycline 脱氧土霉素 强力霉素 美他环素 METC metacycline 两性 二甲胺基弱碱性 酚羟基 烯醇型羟基弱酸性 1 酸碱性 二 性质 两性 OH 游离四环素 四环素盐 溶解性 临床上多用盐酸盐 2 旋光性手性C 3 UV共轭体系 pH3 7 5有强烈荧光 1 差向异构化 5 不稳定性 土霉素 多西环素 美他环素不易差向异构化 2 降解性质 A 酸性下降解 四环素 四环素 B 碱性下降解 荧光 二 鉴别试验 1 硫酸反应 氧化 脱水 例盐酸金霉素Ch P 2005 鉴别 1 取本品约0 5mg 加硫酸2ml即显蓝色 渐变为橄榄绿色 加水1ml后 显金黄色或棕黄色 2 与三氯化铁反应 酚羟基 例盐酸金霉素ChP 1995 鉴别 2 取本品约5mg 加水1ml溶解后 加三氯化铁试液与乙醇的混合液 1 10 2滴 即显深褐色 3 TLC法 薄层板硅藻土pH7 0 黏合剂EDTA 甘油 展开剂乙酸乙酯 三氯甲烷 丙酮 2 2 1 含EDTA 例盐酸土霉素Ch P 2005 鉴别 2 取本品与土霉素 盐酸金霉素及盐酸四环素对照品 分别加甲醇制成每1ml中含1mg的溶液 另取土霉素 盐酸金霉素及盐酸四环素对照品 加甲醇制成每1ml中含上述三种对照品各1mg的混合溶液 照薄层色谱法 附录 B 试验 吸取上述五种溶液各1 l 分别点于同一薄层板上 取4 乙二胺四醋酸二钠溶液 pH7 0 5ml 加至乙酸乙酯 三氯甲烷 丙酮 2 2 1 200ml中为展开剂 展开后 晾干 用氨蒸气熏后 置紫外光灯 365nm 下检视 混合溶液应显示三个明显斑点 供试品溶液所显斑点的荧光强度及位置应与相应的对照品溶液的斑点相同 4 HPLC法 例盐酸四环素Ch P 2005 鉴别 2 在含量测定项下记录的色谱图中 供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致 盐酸土霉素 盐酸金霉素 盐酸多西环素 盐酸美他环素 5 比旋度 手性C 例盐酸四霉素Ch P 2005 性状 比旋度取本品 精密称定 加0 01mol L盐酸溶液溶解并定量稀释成每1ml中含10mg的溶液 依法测定 附录 E 比旋度为 240 258 6 光谱法UV FR 例盐酸美他环素Ch P 2005 鉴别 1 取本品 加1mol L盐酸溶液溶液的甲醇溶液 1 100 制成每1ml中含10mg的溶液 照紫外 可见分光光度法 附录 A 测定 在345nm的波长处有最大吸收 其吸光度为0 31 0 33 例盐酸四环素Ch P 2005 鉴别 3 本品的的红外光吸收图谱应与对照的图谱 光谱集332图 一致 7 Cl 反应 三 特殊杂质检查 盐酸四环素 一 有关物质HPLC 差向四环素 脱水四环素 差向脱水四环素 金霉素 例盐酸四环素Ch P 2005 检查 有关物质取本品适量 加0 01mol L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中含2 0mg的溶液 作为供试品溶液 精密量取2ml 置100ml量瓶中 加0 01mol L盐酸溶液稀释至刻度 摇匀 作为对照溶液 照含量测定项下的色谱条件 取对照溶液20 l注入液相色谱仪 调节检测灵敏度使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20 精密量取供试品溶液和对照溶液各20 l 分别注入液相色谱仪 记录色谱图至主成分峰保留时间的4倍 供试品溶液色谱图中如有杂质峰 按校正后的峰面积计算 盐酸四环素 4 差向四环素 盐酸金霉素 脱水四环素和差向脱水四环素的校正因子分别为1 0 1 15