研究生分子生物学期末总结.doc

名词解释：1. 分子生物学：是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的结构与功能相互关系的科学，是从分子水平研究生命的本质。2. 转录激活：复制引发的关键步骤就是前导链DNA的合成，一旦前导链DNA的聚合作用开始，滞后链上的DNA合成也随着开始，在所有前导链开始聚合之前有一必需的步骤就是由RNA聚合酶(不是引物酶)沿滞后链模板转录一短的RNA分子。在有些DNA复制中，(如质粒ColE)，该RNA分子经过加式成为DNA复制的引物。但是，在大部分DNA复制中，该RNA分子没有引物作用。它的作用似乎只是分开两条DNA链，暴露出某些特定序列以便引发体与之结合，在前导链模板DNA上开始合成RNA引物，这个过程称为转录激活(transcriptional activation)。3. PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应：是指在DNA 聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、 退 火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。 是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。4. 依赖DNA的RNA聚合酶（DDRP)：以DNA为模板，以四种三磷酸核苷为底物，转录的方式是不对称的，RNA链的延长方向是53的连续合成， 需要Mg2+或Mn2+，RNA聚合酶缺乏35外切酶活性，不需要引物 。5. 核心酶：细菌全酶由六个亚基组成，去掉亚基的部分称为核心酶（2 ）6. 启动子：RNA聚合酶起始RNA合成所特异结合的DNA序列，位于转录起始点上游。7. Rho因子：是分子质量为2.0xl05的六聚体蛋白，它是ATP酶，它通过催化ATP的水解促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。依赖于Rho因子的转录终止区DNA序列无共性， Rho因子不能识别这些终止位点。RNA合成起始以后，Rho因子即附着在新生的RNA链上，靠ATP水解产生的能量，沿着53方向朝RNA聚合酶移动，到达RNA的3-OH端后取代了暂停在终止位点上的RNA聚合酶，使之从模板DNA上释放出来，同时释放mRNA，完成转录过程。8. 核心启动子元件(core promoter element ,CPE)指RNA聚合酶起始转录所必需的最小的DNA序列。9. 上游启动子元件(upstream promoter element ,UPE)或称上游激活序列（upstream activating sequence, UAS)：包括通常位于70bp附近的CAAT盒和GC盒、以及距转录起始点更远的上游元件。10. 翻译：是指将mRNA链上的核苷酸从一个特定的起始位点开始，按每3个核苷酸代表一个氨基酸的原则，依次合成一条多肽链的过程。这3个核苷酸称为密码，也叫三联子密码（codon） 。11. 开放阅读框（open reading frame）：是结构基因的正常核苷酸序列，从起始密码子到终止密码子的阅读框可编码完整的多肽链，其间不存在使翻译中断的终止密码子。 12. 密码的简并性（degeneracy）： 由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为简并（degeneracy），对应于同一种氨基酸的几个密码子称为同义密码子。 13. 摆动假说（wobble hypothesis）：在密码子与反密码子的配对中，前两对严格遵守碱基配对原则，第三对碱基有一定的自由度，可以“摆动”，因而使某些tRNA可以识别1个以上的密码子。反密码子第一位为A或C时只能识别1种密码子，为G或U时可以识别2种密码子，为I时可识别3种密码子。14. 起始tRNA和延伸tRNA：能特异地识别mRNA模板上起始密码子的一类tRNA叫起始tRNA，其他tRNA统称为延伸tRNA。原核生物起始tRNA携带甲酰甲硫氨酸(fMet)，即 fMettRNAfMet 。真核生物起始tRNA携带甲硫氨酸(Met)， 即 MettRNAiMet 。15. 同工tRNA：一种氨基酸可能有多个密码子，代表一种氨基酸的多个tRNA以不同的反密码子为特征，识别mRNA上代表一种氨基酸的多个密码子。几个代表相同氨基酸的tRNA称为同工tRNA。16. 无义突变：在蛋白质的结构基因中，一个核苷酸的改变使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子(UAG、UGA、UAA)，使蛋白质合成提前终止，合成无功能的或无意义的多肽，这种突变称为无义突变(nonsense mutation)。无义突变的校正tRNA可通过改变其反密码子区校正无义突变。17. 错义突变（missense mutation）：是由于结构基因中某个核苷酸的变化使一种氨基酸的密码变成另一种氨基酸的密码。 错义突变的校正tRNA通过反密码子区的改变把正确的氨基酸加到肽链上，合成正常的蛋白质。18. 氨酰-tRNA合成酶：是一类催化氨基酸与tRNA结合的特异性酶。其反应包括两步：氨基酸 ATP-E 氨基酰-AMP-E PPi ；氨基酰-AMP-E tRNA 氨基酰-tRNA AMP E。氨基酰-tRNA合成酶对底物氨基酸和tRNA都有高度特异性。存在20种以上具有氨基酸专一性的氨酰tRNA合成酶。氨基酰-tRNA合成酶具有校正活性。19. 释放因子：类释放因子识别终止密码子，催化多肽链从P位点的tRNA中水解释放出来。 RF1：识别终止密码子UAA和UAG RF2：识别终止密码子UAA和UGA 类释放因子在多肽链释放后刺激类释放因子从核糖体中解离出来。 RF3：具GTP酶活性，协助肽链的释放和RF1、RF2的解离。 20. 分子伴侣（molecular chaperone）：细胞内辅助新生肽链正确折叠的蛋白质。一类序列上没有相关性但有共同功能的保守蛋白。21. 热休克蛋白：应激反应性蛋白，广泛存在于原核和真核细胞中。三者协同作用，促使某些能自发折叠的蛋白质正确折叠。22. 伴侣素（chaperonin）：为非自发性折叠蛋白提供能折叠成天然构象的微环境。23. 翻译转运同步机制：蛋白质的合成和运转同时发生。24. 翻译后转运机制：蛋白质从核糖体上释放后才发生运转。 25. 信号肽：常指新合成多肽链中用于指导蛋白质跨膜转移的N-末端氨基酸序列（有时不一定在N端）。一般带有10-15个疏水氨基酸，N-端常常有1个或数个带正电荷的氨基酸，C-末端靠近蛋白酶切割位点处常常带有数个极性氨基酸。26. 信号肽假说：在起始密码之后紧接着大部分是疏水氨基酸的信号肽，信号肽开始从核糖体的大亚基露出，便与内质网膜上的特定受体相互作用，产生通道，允许多肽在延长的同时穿过膜结构。信号肽过膜后被内质网腔的信号肽酶水解，新生肽随之通过蛋白孔道穿越疏水的双层磷脂。当核糖体移到mRNA的终止密码子，蛋白质合成即告完成，翻译体系解散，膜上的蛋白孔道消失，核糖体重新处于自由状态。27. cDNA：是指互补于mRNA的DNA分子（complementary DNA）。cDNA是由RNA经一种称为逆转录酶的DNA聚合酶催化产生的。28. 增强子: 位于真核基因中远离转录起始点，能明显增强启动子转录效率的特殊DNA序列。它可位于被增强的转录基因的上游或下游，也可相距靶基因较远。29. 衰减子：在色氨酸操纵子中的一个区域，此区域以形成不同二级结构的方式，利用原核生物转录与翻译的偶联对转录进行调节。此区域只存在于原核生物合成代谢的操纵子中。30. 减色效应：变性DNA复性后,在260nm的吸收值减少的现象称为减色效应。31. 增色效应：当核酸变性后,其260nm的紫外吸收增加的现象。32. 复制子：含有一个起点的复制单位。其长度等于相邻两个复制起点间的距离。33. C值：真核生物单倍体基因组所包含的全部DNA量称为该物种的C值。34. 终止因子：协助RNA聚合酶识别终止信号的蛋白因子称为终止因子。35. 操纵基因：编码合成那些参与基因表达调控的RNA和蛋白质的特异DNA序列。36. 阻遏蛋白：阻遏蛋白是负调控系统中由调解基因编码的调解蛋白，它本身或与辅阻遏物一起结合于操纵基因，阻遏操纵子结构基因的转录。37. 启动子：是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列。38. 顺式作用元件:是指那些与结构基因表达调控相关、能够被基因调控蛋白特异性识别和结合的特异DNA序列。包括启动子、上游启动子元件、增强子、加尾信号和一些反应元件等。39. 反式作用因子:是指真核细胞内含有的大量可以通过直接或间接结合顺式作用元件而调节基因转录活性的蛋白质因子。40. SSCP:单链构象多态性检测是一种基于DNA构象差别来检测点突变的方法。相同长度的单链DNA，如果碱基序列不同，形成的构象就不同，这样就形成了单链构象多态性。41. SD序列:转录出的mRNA要进入核糖体上进行翻译，需要一段富含嘌呤的核苷酸序列与大肠杆菌16S rRNA3，末端富含嘧啶的序列互补，是核糖体的识别位点。42. CAP:是大肠杆菌分解代谢物基因活化蛋白，这种蛋白可将葡萄糖饥饿信号传递个许多操纵子，使细菌在缺乏葡萄糖时可以利用其他碳源。43. 顺反子:原核生物DNA序列功能相关的RNA和蛋白质基因，集中在基因组的一个或者几个特定的部分形成的功能单位或者转录单位。44. 分子伴侣：使一些蛋白质装备或者恰当折叠所需的蛋白质，但是这种蛋白质并不是目标复合物的成分。45. 阻遏蛋白：与DNA 或RNA结合来阻止转录或者翻译的蛋白质。46. 限制性图谱：DNA上能够被很多不同限制性酶切割的位点排列。47. 干扰RNA: 一些小的双链RNA可以高效、特异的阻断体内特定基因表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型。大题：l DNA复制 1. 2个关键的底物：（1）4种脱氧核苷三磷酸dGTP、dCTP、dATP、dTTP。 （2）引物：与模板互补，比模板短的一小段序列，暴露的3-OH。2. 复制方向：5-33. 焦磷酸水解是DNA合成的驱动力4. 过程：1DNA双螺旋的解旋 DNA在复制时，其双链首先解开，形成复制叉，而复制叉的形成则是由多种蛋白质及酶参与的较复杂的复制过程 （1）单链DNA结合蛋白（SSB）SSB是较牢固的结合在单链DNA上的蛋白质。原核生物SSB与DNA结合时表现出协同效应：若第1个SSB结合到DNA上去能力为1，第2个的结合能力可高达103；真核生物细胞中的SSB与单链DNA结合时则不表现上述效应。SSB的作用是保证解旋酶解开的单链在复制完成前能保持单链结构，它以四聚体的形式存在于复制叉处，待单链复制后才脱下来，重新循环。所以，SSB只保持单链的存在，不起解旋作用。 （2）DNA解链酶（DNA helicase） DNA解链酶能通过水解ATP获得能量以解开双链DNA。这种解链酶分解AT的活性依赖于单链DNA的存在。如果双链DNA中有单链末端或切口，则 DNA解链酶可以首先结合在这一部分，然后逐步向双链方向移动。复制时，大部分DNA解旋酶可沿滞后模板的53方向并随着复制叉的前进而移动。 （3）DNA解链过程 DNA在复制前不仅是双螺旋而且处于超螺旋状态，而超螺旋状态的存在是解链前的必须结构状态，参与解链的除解链酶外还有一些特定蛋白质，如大肠杆菌中的 Dna蛋白等。一旦DNA局部双链解开，就必须有SSB以稳定解开的单链，保证此局部不会恢复成双链。 2复制的引发、延伸和终止 DNA复制时，往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由聚合酶从RNA引物3端开始合成新的DNA链。对于前导链来说，这一引发过程比较简单，只要有一段RNA引物，DNA聚合酶就能以此为起点，一直合成下去。对于后随链，引发过程较为复杂，需要多种蛋白质和酶参与。后随链的引发过程由引发体来完成。引发体由6种蛋白质构成，预引体或引体前体把这6种蛋白质结合在一起并和引发酶或引物过程酶进一步组装形成引发体。引发体似火车头一样在后随链分叉的方向前进，并在模板上断断续续的引发生成滞后链的引物RNA短链，再由DNA聚合酶 III 作用合成DNA，直至遇到下一个引物或冈崎片段为止。由RNA酶H降解RNA引物并由DNA聚合酶 I 将缺口补齐，再由DNA连接酶将每两个冈崎片段连在一起形成大分子DNA.。l PCR 1. 原理：类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。经不断重复循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应是2n,实得1.8n.2. 体外PCR扩增与体内DNA复制之间的关系： PCR扩增过程和体内DNA复制过程最大的不同就是：PCR扩增中2条单链完全解开，分别同时以5一3方向连续合成；而DNA复制边解旋边复制，出现前导链和滞后链，在滞后链形成冈崎片段。3. 实际应用中的优化：优化引物、镁离子、模板DNA、热稳定DNA聚合酶及dNTP的浓度，控制变性温度和时间。引物：如果引物二聚体过量，应用降落PCR和热启动PCR；若问题仍然存在，重新设计合成引物通过建立两个引物不同浓度的PCR系列试验，从中发现两个引物的最适浓度，要特别注意引物3末端的序列。镁离子：通过建立降落PCR系列试验，摸索最佳镁离子浓度的水平。模板DNA: 检查模板DNA序列内是否具有高度重复序列存在。如存在，降低模板DNA的量。变性不完全：增加变性的时间或者设置更高的变性温度。两个引物之间的距离太大：应用那些能够扩增大DNA片段的热稳定DNA聚合酶。l 凝胶电泳原理：生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，所以，DNA和RNA又被称为多聚阴离子，在电场中向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶染色,在紫外光下呈橘黄色,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。常用的凝胶电泳包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.250kb之间。聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱基对之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广，尤其适于分离大片段DNA。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电场凝胶电泳，可分离高达107bp的DNA片段。l 核酸分子杂交 基本原理：是具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下（适宜的温度及离子强度等）可按碱基互补原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。杂交的双方是待测核酸及探针。探针以放射核素或非放射性核素标记，以利于杂交信号的检测。分子杂交的实质是DNA的变性和复性过程。 DNA的变性解链是杂交成功的关键, DNA受酸、碱、热等处理均能发生变性，但强酸会使核酸降解。碱变性可避免DNA的降解、热变性要在低DNA浓度（100g/ml）和低盐浓度（0.1 SSC 15mmol/L NaOH，1.5mmol/L柠檬酸三钠，pH7.0)下进行。DNA变性可用OD260增加（约30-40%）来检测，变性DNA醇沉淀呈雪样，完全失去纤维状沉淀。 核酸探针是指能与特定核酸序列发生特异性互补的已知核酸片段。一般而言，核酸探针带有特殊的标记物。常用的核酸探针：（1）双链cDNA （2）单链cDNA；（3）合成寡核苷酸；（4）单链cRNA。 Southern印迹杂交的基本方法：将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段，然后经碱变性，Tris缓冲液中和和高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素膜上、烘干固定后即可用于杂交。凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着，附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确立探针互补的每一条DNA带的位置，从而可以确定在众多消化产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。 Northern印迹杂交（Northern blot）：原理是RNA经过变性琼脂糖凝胶电泳分离后，转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，经过杂交，分析mRNA的大小及含量。应用：半定量分析mRNA的含量；确定mRNA分子的大小。方法：提取组织细胞总RNARNA定量变性胶电泳转膜干膜预杂交杂交洗膜压片洗片图像分析。原位杂交（Tissue in situ hybridization）：含有互补顺序的标记DNA或RNA片段（探针），在适宜的条件下与细胞内特定的DNA或RNA形成稳定的杂交体。可用来观察目的基因或mRNA 在细胞中的定位；半定量分析其含量变化。斑点杂交（Dot blot）：是将被检标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量分析。一张膜上可同时检测多个样品，为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪，它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状。反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。基本过程:首先变性DNA样品，然后直接点样于硝酸纤维素薄膜上使之成为斑点，然后与探针杂交。l 特定基因片段的获取1.DNA克隆/重组 定义：构建重组DNA分子并在细胞中保存和扩增这些分子。即应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA相结合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子，即DNA克隆。 过程：a 载体的选择和制备分； 载体要素：自我复制能力；携带外源基因片段大小；插入位点多少；易于鉴定识别程度。大肠杆菌pSC101质粒载体：低拷贝数严紧型复制控制的大肠杆菌质粒载体，平均每个寄主细胞仅有12个拷贝。pBR322质粒载体：优点是具有较小的分子量，其长度为4 363bp。不仅易于纯化，而且即使携带上一段6-8kb的外源DNA片段，操作起来仍较为便利。具有两种抗生素抗性基因以用作转化子的选择记号。有较高的拷贝数，若经过氯霉素扩增，每个细胞中可累积10003000个拷贝，为重组体DNA的制备提供了极大的方便。b 制备目的基因片段切； 化学合成法；基因组DNA（限制性内切酶）；cDNA；PCRc DNA片段的重组连接接；（DNA连接酶）d 重组DNA导入受体细胞转；e 转化子的筛选筛；（导入外源DNA分子后能稳定存在的宿主细胞称转化子）f 重组子的筛选筛；（导入的外源DNA为重组DNA的转化子） 根据载体的性状变化进行筛选：根据载体的抗药性标记进行筛选；根据载体抗药性插入失活筛选。 根据外源性DNA片段性状进行筛选：根据外源基因可能表达的蛋白质对缺乏该蛋白的细菌的影响。 根据重组DNA的结构特征进行筛选：根据重组DNA和载体DNA大小的差别进行电泳分离判断；限制性内切酶图谱分析。g 重组子的鉴定鉴；h 克隆扩增或表达扩/表达；应用：基因文库（最大的应用）用重组体DNA技术将某种生物细胞中的染色体基因组DNA或cDNA 的所有片段随机的连接到载体上，然后转移到适当的寄主细胞中，通过细胞增殖而构成各个片段的无性繁殖系，当其数目多到可以覆盖某生物的全部DNA或cDNA时，这一组克隆称为某种生物的基因文库。 基因组文库：用基因组DNA制作的基因文库。cDNA文库:用某一组织细胞的全部mRNA反转录形成总cDNA然后制成的基因文库。2.PCR扩增（同上）l RT-PCR定义：逆/反转录PCR，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。原理：提取组织细胞总RNA，以其中的mRNA为模板，采用 olig-dT或随机引物，在逆转录酶的作用下反转录成cDNA。再以cDNA作为模板，通过特异性引物，PCR扩增目的基因。方法：提取组织或细胞总RNA紫外定量逆转录合成cDNAPCR扩增电泳摄像光密度扫描图像分析应用：用于测定基因表达的强度和鉴定已转录序列是否发生突变,呈现mRNA多态性,克隆mRNA的5和3末端序列,以及从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库。l RNA分析方法（见课件） l 蛋白质的研究技术（见课件）l 基因表达分析原核表达系统大肠杆菌表达系统 一、原核生物细胞表达的特点 (1)原核生物只有一种RNA聚合酶识别原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。 (2)原核生物的表达是以操纵子为单位的。操纵子是数个相关的结构基因及其调控区的结合，是一个基因表达的协同单位。(3)原核生物的转录与翻译是偶联的，也是连续 进行的。每个核糖体可独立完成一条多肽链的合成，即这种多核糖体可以同时在一条mRNA链上合成多条肽链，大 大提高了翻译效率。(4)原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。因此当克隆的含有内含子的真核基因在原核细胞中转录成mRNA前体后，其中内含子部分不能被切除。(5)原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对基因产物直接控制要慢。对RNA合成的控制有2种方式：一是起始控制(启动子控制)，二是终止控制(衰减子控制)。(6)在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个翻译起始密码子及同16S RNA 3末端碱基互补的序列，即SD序列。二、外源基因在原核细胞中表达具备条件(1)通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白。(2)外源基因不能带有间隔顺序(内含子)，因而必须用cDNA或全化学合成基因，而不能用基因组DNA。(3)必须利用原核细胞的强启动子和SD序列等调控元件控制外源基因的表达。(4)外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架(ORF)。 ORF(open reading frame)：起始于AUG、止于UAA、UGA、UAG的连续的密码子区域，是潜在的编码区。(5)利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。三、大肠杆菌表达系统1、大肠杆菌基因表达载体 大肠杆菌基因表达载体的构建，应包括这些基因元件：复制子、启动子、终止子、核糖体结合位点、密码子、选择标记等。2、宿主菌 大肠杆菌基因表达系统的基因一般都是异源基因，某些甚至是真核生物基因，而在细胞内积累大量的异源蛋白极易被降解。造成重组异源蛋白在大肠杆菌中不稳定的原因包括：大肠杆菌缺乏复杂翻译后加工和蛋白质折叠系统；大肠杆菌不具备类似真核细胞的亚细胞结构和表达产物的稳定因子；大量的异源重组蛋白在大肠杆菌细胞中形成高浓度微环境，导致蛋白质分子之间的作用增强。为了使外源基因高效表达，必须构建作为基因表达受体菌的大肠杆菌工程菌株。 3、常见的大肠杆菌基因表达系统 目前较为广泛应用的表达系统包括以下几种：Lac和Tac表达系统、PL和PR表达系统、T7表达系统等。四、提高克隆基因在大肠杆菌中表达效率的途径1、优化表达载体的设计 (1)提高启动子的转录效率 有效的转录起始是外源基因能否在宿主细胞中高效表达的关键步骤之一，转录起始的速率是基因表达的主要限速步骤。因此，选择强的可调控启动子及相关的调控序列，是组建一个高效表达载体首先要考虑的问题。最理想的可调控启动子: 发酵早期阶段表达载体的启动子被紧紧地阻遏，这样可以避免出现表达载体不稳定、细胞生长缓慢或由于产物表达而引起细胞死亡等问题。当细胞数目达到一定的密度，通过多种诱导(如温度、药物等)使阻遏物失活，RNA聚合酶快速起始转录。(2)保证核糖体结合位点的有效性 SD序列是指原核细胞mRNA 5端非翻译区同16S rRNA 3端的互补序列。按统计学的原则，一般SD序列至少含AGGAGG序列中4个碱基。SD序列存在对原核细胞mRNA翻译起始至关重要。(3)提供有效的转录终止区 在基因的3端除了终止密码子之外，还要有一段富含A/T区域和一段富含G/C区域，G/C的区域又具有迴文结构，这段终止子转录后，形成的RNA具有茎环结构。这样可以防止由于克隆的外源基因表达干扰了载体系统的稳定性。2、增加表达质粒的拷贝数和稳定性多数情况下，目标基因的扩增程度同基因表达成正比，对于原核和酵母表达体系而言，选择高拷贝数的质粒，以其为基础，组建表达载体, 可以获得较高水平的表达。表达载体的稳定性是维持基因表达的必需条件，而表达载体的稳定性不但同表达载体自身特性有关，也与受体细胞的特性密切相关。所以在实际运用时，尽量减少表达载体的大小、通过建立可整合到染色体中去的载体等方式，可以增加表达质粒的稳定性。3、提高翻译水平的效率(1)SD序列与起始密码子之间距离以93碱基为适宜。(2)尽量避免使用罕用密码子如：AGG、AGA(Arg)、CUA(Leu)等，使用高频率的密码子。(3)增加mRNA的稳定性。在外源