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愈伤组织的诱导与分化 愈伤组织的形态发生 愈伤组织培养的应用 愈伤组织的继代培养 复习思考题 愈伤组织培养 植物组织培养 1 愈伤组织培养 植物组织培养 第五章 2 愈伤组织培养 植物组织培养 愈伤组织源出于自然生长的植物受损伤时 在愈合伤口处长出的一团瘤状突起 瘤状突起内的细胞相对于植物体成熟细胞已发生脱分化的变化 这一概念后来被引入植物组织培养领域 培养中的愈伤组织是指从外植体的内部或切口表面形成的一团没有分化的组织 这种组织具有再分化的能力 愈伤组织 第五章 3 愈伤组织培养 愈伤组织培养将母体植株上的各个部分切下作为外值体 接种到无菌的培养基上 进行愈伤组织诱导 生长和发育的一门技术 一般情况下 植物组织均能诱发形成愈伤组织 愈伤组织培养 4 第一节愈伤组织的诱导与分化 愈伤组织培养 一 愈伤组织的诱导二 愈伤组织细胞的分化 5 一 愈伤组织的诱导 愈伤组织培养 植物由细胞构成 细胞是生物结构和生命活动的基本单位 具有全能性 即一个植物细胞能产生一个完整植株的固有能力 或植物细胞具有全套遗传信息 不论是性细胞还是体细胞 在特定环境下能进行表达 而产生一个独立完整的个体 第一节愈伤组织的诱导与分化 6 一 愈伤组织的诱导 愈伤组织培养 全能性的体现一个已分化的细胞若要表现其全能性 首先要经历脱分化过程 然后再经历再分化过程 脱分化 一个已停止分裂的成熟细胞转变为分生状态 并形成未分化的愈伤组织的现象 第一节愈伤组织的诱导与分化 7 一 愈伤组织的诱导 不同外植体的比较 一般双子叶植物比单子叶和裸子植物诱导愈伤组织容易 幼年细胞和组织比成年细胞和组织容易 二倍体细胞比单倍体细胞容易 第一节愈伤组织的诱导与分化 胡萝卜愈伤组织 8 一 愈伤组织的诱导 愈伤组织培养 在进行愈伤组织培养中 应根据不同的培养目的 获取不同的外植体 外源激素是植物愈伤组织诱导过程中不可缺少的组成成分 第一节愈伤组织的诱导与分化 9 二 愈伤组织细胞的分化 从单个细胞或外植体上形成典型的愈伤组织 大致要经历三个时期 一 诱导期 二 分裂期 三 分化期 第一节愈伤组织的诱导与分化 10 二 愈伤组织细胞的分化 再分化 愈伤组织在一定的培养条件下又可以经过胚胎发生形成双极性的胚状体 或经过器官发生形成单极性的芽或根 进而重新形成完整的植株 这后一段过程一般称为再分化 第一节愈伤组织的诱导与分化 11 二 愈伤组织细胞的分化 从单个细胞或外植体上形成典型的愈伤组织 大致要经历三个时期 一 诱导期 二 分裂期 三 分化期 第一节愈伤组织的诱导与分化 12 二 愈伤组织细胞的分化 愈伤组织培养 一 诱导期 诱导期又称起动期 指细胞准备进行分裂的时期 由于接种的植物材料的组成细胞通常都是成熟细胞 处在静止状态 一般不进行分裂 诱导期的长短 因植物种类和外植体的生理状况及外部因素而异 菊芋1d 胡萝卜几天 不同的光照条件 诱导情况不同 一般弱光易于诱导 且分裂频率高 第一节愈伤组织的诱导与分化 13 二 愈伤组织细胞的分化 愈伤组织培养 外源激素是愈伤组织诱导过程中不可缺少的组成成分 是一种诱导剂 能诱导细胞开始分裂 外源生长物质往往是通过调整它的种类和浓度来诱导细胞开始分裂的 最常用的有2 4 D NAA IAA和细胞分裂素等 2 4 D处理静止状态的组织时 细胞的RNA含量明显增加 而且2 4 D可积累在分裂细胞的核仁中 组织的机械损伤也作为一种刺激因素诱导细胞开始分裂 愈伤组织往往出现在伤口处 有些天然提取物对愈伤组织的诱导和维持十分有益 常用的有椰子汁 10 0 5 的酵母提取物 5 10 的番茄汁 第一节愈伤组织的诱导与分化 14 二 愈伤组织细胞的分化 愈伤组织培养 离体培养的细胞在分裂前发生的变化 在切离和培养后较短时间内 细胞的气体交换迅速增加 特别是在加有生长素的培养基中培养时 比无生长素的培养基中气体交换增加一倍 多聚核糖体不断增加 截止M期前 每个细胞中的RNA含量增加到300 蛋白质发生周期性的积累 每个分裂细胞的总增加量约为200 酶活力也发生一定的变化 DNA复制前 DNA聚合酶活力增加 分裂前 与代谢有关的酶类 如己糖激酶和一些脱氢酶的活力也增加 第一节愈伤组织的诱导与分化 15 愈伤组织培养 二 分裂期分裂期指细胞通过一分为二的方式 不断增生子细胞的过程 外植体的细胞一但经过诱导 细胞脱分化 其外层细胞开始细胞分裂 细胞的数目迅速增加 胡萝卜组织培养7d后 细胞数可增加10倍 每个细胞平均鲜重下降 这是由于鲜重的增加赶不上细胞数目的增加之故 二 愈伤组织细胞的分化 第一节愈伤组织的诱导与分化 16 愈伤组织培养 正在分裂的细胞体积小 内无液泡 如同根尖和茎尖的分生组织细胞一样 细胞的核和核仁增大到最大 细胞中的RNA含量减少 而DNA含量保持不变 随着细胞不断分裂和组织生长 组织的总干重 蛋白质和核酸含量大大增加 新细胞壁的合成极快 处于分裂期的愈伤组织的特征是 细胞分裂快 结构疏松 缺少组织结构 颜色浅而透明 二 愈伤组织细胞的分化 第一节愈伤组织的诱导与分化 17 愈伤组织培养 三 分化期是指停止分裂的细胞发生生理代谢变化而形成由不同形态和功能的细胞组成的愈伤组织 在细胞分裂末期 细胞内开始发生一系列的形态和生理变化 导致细胞在形态和生理功能上的分化 出现形态和功能各异的细胞 分化期愈伤组织内的细胞主要出现下列变化 二 愈伤组织细胞的分化 第一节愈伤组织的诱导与分化 18 愈伤组织培养 1 细胞分裂部位和方向发生改变分裂期的细胞分裂局限在组织的外缘 主要是平周分裂 而在分化期开始后 愈伤组织表层细胞的分裂逐渐减慢 直至停止 进而转向愈伤组织内部深处的局部地区的细胞开始分裂 使分裂面的方向改变了 出现了瘤状结构的外表和内部分化 二 愈伤组织细胞的分化 第一节愈伤组织的诱导与分化 19 愈伤组织培养 2 分生组织瘤状结构和维管组织形成迅速生长的愈伤组织 都是极相似的 而当愈伤组织生长速度减慢时 就会出现特殊的形状和结构 在生长中的愈伤组织 一个共同的特征是 形成由分生组织组成的瘤状结构 变成不再进一步分化的生长中心 并在其周缘产生扩展的薄壁细胞 瘤状结构则成团分散分布在愈伤组织块中 形成了维管组织 但不形成维管系统 而呈分散的节状和短束状结构 它可由木质部组成 也可由木质部 韧皮部乃至形成层组成 细胞分裂素对促进组织维管化有重要作用 二 愈伤组织细胞的分化 第一节愈伤组织的诱导与分化 20 愈伤组织培养 3 细胞的体积不再减小愈伤组织分化时外植体细胞的大小发生十分明显的变化 生长的愈伤组织的细胞平均大小不再减小 至此以后 保持相对不变 4 出现各种类型的细胞如薄壁细胞 分生细胞 管胞 石细胞 纤维细胞 色素细胞 毛状细胞以及细胞丝状体等 5 出现一定的形态特征生长旺盛的愈伤组织一般呈奶黄色或白色 有光泽 也有淡绿色或绿色的 老化的愈伤组织多转变为黄色甚至褐色 二 愈伤组织细胞的分化 第一节愈伤组织的诱导与分化 21 愈伤组织培养 不同外植体来源的愈伤组织有一定的均一性 如叶栅栏组织细胞和根细胞在大小和形态上有一定的差异 但是两者诱导形成的愈伤组织就失去了原有的差异 变得比较均一 若诱导条件不同 愈伤组织的形态和物理性质也有一定的变化 有的紧密坚实 有的疏松脆弱 例如 在柑橘子叶培养中 在MS附加1mg lNAA与0 2mg l6 BA的培养基上形成的愈伤组织紧密坚实呈瘤状 而在MS附加0 2mg l2 4 D与0 2mg l6 BA培养基上形成的愈伤组织则疏松易脆 二 愈伤组织细胞的分化 第一节愈伤组织的诱导与分化 22 愈伤组织培养 质地不同的两种愈伤组织有时是可互变的 有时是不可逆的 脆性愈伤组织由松散排列的细胞组成 而坚实愈伤组织则由紧密排列的细胞组成 加入高浓度的生长物质 可使坚实的愈伤组织变为松脆 反之 减低或除去生长物质 则松脆愈伤组织可转变为坚实 松脆的愈伤组织是进行悬浮培养最适合的材料 稍经机械振荡 即可使组织分散成单细胞或由少数几个细胞组成的小细胞团 在培养中细胞迅速增殖 坚实愈伤组织中的细胞间被果胶质紧紧地粘着 因而往往不能形成良好的悬浮系统 二 愈伤组织细胞的分化 第一节愈伤组织的诱导与分化 23 愈伤组织培养 诱导形成的愈伤组织如果在原培养基上继续培养 细胞将不可避免的发生分化 产生新的结构 但是把它及时转移到新鲜的培养基上 则愈伤组织内的细胞可无限地进行分裂 维持其不分化的状态 一般在愈伤组织长到直径2 3cm时才将其与外植体分离 单独培养 并将其切成小块继续培养 此即继代培养 生长迅速的愈伤组织多呈浅色 质地松散 若要进行愈伤组织的分化和再生 则应选生长较慢的愈伤组织 二 愈伤组织细胞的分化 第一节愈伤组织的诱导与分化 24 第二节愈伤组织的继代培养 愈伤组织培养 一 培养基和培养条件二 继代培养物的分化潜力 25 愈伤组织培养 一 培养基1 无机营养大量元素 微量元素 2 植物生长物质生长素IAA NAA IBA 2 4 D 浓度0 1 10mg l细胞分裂素BA 2 ipKTZT浓度0 1 10mg l植物生长物质之间的配比控制器官发生的类型控制器官发生的类型也受绝对用量的影响 不同的生长素和细胞分裂素 对生根和长芽的效果不同 NAA生根比IBA和IAA效果好 但用IAA和IBA生根比较健壮 而NAA生根较细 一 培养基和培养条件 第二节愈伤组织的继代培养 26 愈伤组织培养 细胞分裂素和生长素使用浓度之间的关系 细胞分裂素 生长素 一 培养基和培养条件 第二节愈伤组织的继代培养 27 愈伤组织培养 3 有机成分糖 硫胺素 烟酸 吡哆醇 肌醇 甘氨酸 水解酪蛋白 水解乳蛋白 糖提供给外植体能量 而且还能维持一定的渗透压 培养基中的渗透压 对细胞增殖和体细胞胚的形成都有十分明显的影响 尤其在花药培养中受到重视 不同种类和浓度的糖 对组织培养的增殖及以后的器官分化均有明显影响 常用的有果糖 葡萄糖 蔗糖等 用量通常为20 70g L 一 培养基和培养条件 第二节愈伤组织的继代培养 28 愈伤组织培养 4 物理性质包括培养基的形式 固态或液态 渗透压和pH等方面 它对形态的发生有明显的作用 在胡萝卜和石刁柏的培养过程中 需要改变培养基的形式 才能顺利地分化出苗 其方法为 在诱导愈伤组织的第一阶段 应在固态琼脂培养基上进行 而细胞和体细胞胚增殖的第二阶段 应在液态培养基中完成 第三阶段由胚状体发育成植株 又应转到固态琼脂培养基上进行培养 一 培养基和培养条件 第二节愈伤组织的继代培养 29 愈伤组织培养 培养基的水分对芽的分化有一定影响 而且往往随培养基的失水和养分消耗而发生变化 培养基的pH应调整到5 6 6 0的范围 过高或过低均会对组织培养有不利影响 一 培养基和培养条件 第二节愈伤组织的继代培养 30 愈伤组织培养 二 培养条件1 光照在组织培养中光对器官的作用是一种诱导反应 而不是提供光合作用的能源 除某些植物组织培养要求在黑暗中生长外 一般均需一定的光照条件 满足苗的形成 根的发生 芽分化和体细胞胚形成等分化和形态建成 一 培养基和培养条件 第二节愈伤组织的继代培养 31 愈伤组织培养 可以通过调节光强 光照时数及光质来满足对光照条件的需要 例如对短日照敏感的葡萄品种 其茎切段的组织培养物只有在短日照条件下才能形成根 对于烟草愈伤组织来说 要诱导芽的形成 有效光谱为蓝光 而红光没有效应 但红光对诱导根的形成有效 蓝光则没效 一 培养基和培养条件 第二节愈伤组织的继代培养 32 愈伤组织培养 一 培养基和培养条件 第二节愈伤组织的继代培养 2 温度在植物组织培养中 采用24 28 的恒温条件进行 对一般植物都可较好地形成芽和根 而有些植物则需要在一定昼夜温差下培养 如菊芋在白天28 和夜间15 的条件下 对根的形成最好 33 愈伤组织培养 继代培养物的分化潜力 主要有以下两个因素对其有影响 1 生理因素2 遗传因素 二 继代培养物的分化潜力 第二节愈伤组织的继代培养 34 愈伤组织培养 1 生理因素在组织培养过程中 逐渐消耗了母体中原有与器官形成有关的特殊物质 而导致继代培养物分化潜力的变化 如胡萝卜组织培养 初代中加入10 6 m的IAA 才能达到最大生长量 但经多次继代培养后 在不加IAA的培养基上也可达到同样生长量 这说明植物材料内部发生了一些生理生化变化 不同植物保持分化潜力的时间不同 且差异大 胡萝卜原来培养过程中丧失分化能力的一些组织 加入腺嘌呤 酪蛋白或酵母汁等物质后 器官分化能力可恢复到一定水平 二 继代培养物的分化潜力 第二节愈伤组织的继代培养 35 愈伤组织培养 2 遗传因素愈伤组织长期继代培养会引起其细胞内的染色体发生变化 如出现多倍体 非整倍体 染色体丢失 染色体断裂或重组 致使材料变为混倍组织 而且随着继代培养次数和时间的增加 变化频率也随之增加 愈伤组织继代培养物染色体的不稳定性 对保持供体植物的遗传稳定性是不利的 但对育种来讲 往往可以利用这种变化 从中筛选出具有有利经济性状 如高产 优质 抗病 的细胞系 供育成新品种之用 二 继代培养物的分化潜力 第二节愈伤组织的继代培养 36 在继代培养中通常出现染色体紊乱 尤其是器官发生型 继代培养中分化能力丧失与遗传不稳定有关 所以 在进行继代培养时 要尽量利用侧芽增殖或苗的途径 而诱导不定芽发生或胚的发生 则有一定危险性 愈伤组织培养 二 继代培养物的分化潜力 第二节愈伤组织的继代培养 37 愈伤组织培养 从外植体形成器官或细胞无性系的形态发生 有以下两种情况 不定芽和不定根的发生体细胞胚的发生 第三节愈伤组织的形态发生 38 一 不定芽和不定根的发生 愈伤组织培养 在植物组织培养中 当外植体形成愈伤组织后 可以利用植物生长物质比例控制器官发生的模式 通过调整某些植物生长物质的比例促使芽和根的分化 一般来说 生长素有利于愈伤组织形成根 细胞分裂素可促进愈伤组织形成芽 第三节愈伤组织的形态发生 39 愈伤组织培养 1 愈伤组织仅有芽或根器官的分别形成 即无芽的根或无根的芽 2 先形成芽 再在芽伸长后 在其茎的基部长出根而形成小植株 大多植物为这种情况 愈伤组织的器官发生顺序有四种情况 一 不定芽和不定根的发生 第三节愈伤组织的形态发生 40 愈伤组织培养 3 先产生根 再从根的基部分化出芽形成小植株 4 先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽和根 然后两者结合起来形成一株小植株 类似根芽的天然嫁接 但这种情况少见 而且一定在芽与根的维管束是相通的情况下 才能得到成活植株 一 不定芽和不定根的发生 第三节愈伤组织的形态发生 百合鳞片形成小鳞茎和不定根 41 愈伤组织培养 高等植物的体细胞在一定条件下所诱导形成的胚 称为体细胞胚 即所谓的胚状体 植物的体细胞具有形成胚的潜力 在植物组织培养中 培养细胞经诱导分化出具有胚芽 胚根 胚轴的胚状结构 进而长成完整植株 二 体细胞胚胎的形成 第三节愈伤组织的形态发生 42 二 体细胞