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文档简介

紫外分光光度法测定血清蛋白质 临床生化实验室 一 实验目的 掌握紫外分光光度法测定血清蛋白质的原理 学习754型紫外分光光度计的使用方法 二 实验原理 大多数蛋白质中酪氨酸 色氨酸 苯丙氨酸残基的苯环含有共轭双键 所以蛋白质溶液在280nm具有一个紫外吸收高峰 在一定浓度范围内 蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比 因此可作蛋白质定量分析 二 实验原理 由于生物样品中常混有核酸 核酸中的碱基对紫外也有吸收 但其峰值在260nm附近 因此可用下列公式计算蛋白质浓度 Lowry Kalckar公式 蛋白质浓度 g L 1 45A280 0 74A260 100 A280和A260分别代表光径为1cm时蛋白质溶液在280nm和260nm处测得的吸光度值 三 实验操作 一 实验操作步骤1 取待测血清0 1ml于大号试管内2 取生理盐水9 9ml加入到此试管内 边放边震荡 轻轻混匀3 生理盐水调零 测定波长280nm及波长260nm的吸光度值 三 实验操作 二 紫外分光光度计的使用方法1 接通电源 打开仪器开关 预热10min2 调波长为260nm3 依次把生理盐水 待测液倒入比色杯内 放入比色槽4 推动拉杆至最前方 以生理盐水调零6 测定待测液的值7 调波长为280nm 重复3 6步的操作 四 结果计算 计算公式 蛋白质浓度 g L 1 45A280 0 74A260 100 参考范围 正常人 60 80g L 五 方法学评价 紫外法优缺点 优点操作简便 可保留蛋白生物活性 没有发生化学反应 标本可重复利用 五 方法学评价 紫外法优缺点 缺点各种蛋白质中芳香族氨基酸含量和比例不同 因此测定有一定误差 在280nm测定易受尿酸和胆红素的干扰 导致准确性和特异性受影响 若样品种含有嘌呤嘧啶等会出现比较大的干扰 此时必须同时测定260和280nm吸光度 通过公式校正测定 以消除核酸的影响 而推算出蛋白质浓度 临床意义见双缩脲法 六 注意事项 需用石英比色杯 光径 1cm 拿法同722型比色杯 价值昂贵 用时小心双用10ml的吸量管取生理盐水时 先查看吸量管刻度是否到尖端 若到尖端 应先放掉0 1ml 再将剩下的9 9ml液体放入试管中 六 注意事项 由于各种蛋白质的酪氨酸和苯丙氨酸含量不同 显色深浅随不同蛋白质改变 因而本法只适用于蛋白质相对浓度的测定 核酸对
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