KRAS和EGFR检测与临床应用PPT课件.ppt

KRAS和EGFR检测与临床应用 1 汇报内容 KRAS和EGFR的简介及临床意义ARMS PCR的基本原理和技术特点等位特异性引物设计KRAS试剂盒开发简介 2 KRAS和EGFR的简介及临床意义 3 KRAS背景 KRAS是一种原癌基因 长约35kb 位于12号染色体 是RAS基因家族成员之一 编码的蛋白主要参与PI3K PTEN AKT和RAF MEK ERK信号通路的调控 EGFR在通路中位于KRAS上游 配体与之结合后可以激发其酪氨酸激酶活性 导致KRAS的活化和通路中信号传导 KRAS是许多恶性肿瘤的常见突变基因 胰腺癌 65 90 结直肠癌 40 肺癌 20 卵巢癌 15 4 KRAS基因突变影响结直肠癌药物疗效 KRAS基因野生型的转移性结直肠癌患者能从EGF抗体 西妥昔单抗 帕尼单抗 治疗中获益 而基因突变的患者治疗效果很差 KRAS突变型患者对西妥昔单抗无应答 其总体生存期明显低于KRAS野生型患者 KarapetisCS 2008 NEngJMed 5 结直肠癌患者检测KRAS突变相关指南 欧洲药品评估局 EMEA 2008 指出 KRAS野生型的进展期结直肠癌患者可能从帕尼单抗中受益 而突变型患者受益较少 美国临床肿瘤学会 ASCO 2009 推荐 转移性结直肠癌患者应检测KRAS突变 如有KRAS12 13位突变 则不应进行EGFR单克隆抗体治疗 美国FDA指南推荐 在使用靶向药物西妥昔单抗和帕尼单抗治疗转移性结肠直肠癌前必须检测KRAS基因的基因型 2012年7月6日批准第一个用于结直肠癌的基因检测 Qiagen 以判断西妥昔单抗是否有效 美国国立综合癌症网络 NCCN 2014 指南说 转移性结直肠癌患者均应进行RAS突变检测 KRAS和NRAS 至少应检测KRAS第二外显子的突变情况 KRAS或NRAS突变型的病人不应采取西妥昔单抗或帕尼单抗治疗 中国卫生部于2010年10月14日发表了 结直肠癌诊疗规范 2010版 明确指出在患者确定为复发或转移性结直肠癌接受西妥昔单抗 帕尼单抗时 必须检测肿瘤组织的K ras基因状态 在晚期 转移性结直肠癌化疗中 在治疗前检测肿瘤K ras基因状态 EGFR不推荐作为常规检查项目 6 KRAS基因突变影响非小细胞肺癌药物疗效 KRAS基因野生型的非小细胞肺癌患者能从小分子酪氨酸激酶抑制剂 TKI 如吉非替尼 厄洛替尼 治疗中获益 而基因突变的患者易发生抵抗 KRAS突变型患者使用厄洛替尼联合化疗后 其无症状生存期和总生存期明显低于野生型患者 图中红线所示 AndersonSM 2011 ExpertRev Mol DiagnEberhardDA 2005 JClinOncol 7 非小细胞肺癌患者检测KRAS突变相关指南 美国国立综合癌症网络 NCCN 2009 指出 KRAS突变与非小细胞肺癌患者TKI抵抗有关 KRAS基因测序有助于确定哪些病人适合TKI治疗 当KRAS基因发生了突变 则不建议病人使用厄洛替尼进行分子靶向治疗 8 KRAS主要突变位点 在结直肠癌中 KRAS突变主要发生于codon12 80 codon13 15 20 codon61和146 5 在肺癌中 约97 的KRAS突变发生于codon12 13 其余位于codon61和146 9 EGFR突变背景 EGFR基因位于染色体7p11 2 大小约200kb 是上皮生长因子 EGF 细胞增殖和信号传导的受体 EGFR等蛋白酪氨酸激酶功能缺失或其相关信号通路中关键因子的活性或细胞定位异常 与肿瘤细胞的增殖 血管生成 肿瘤侵袭 转移及细胞凋亡的抑制有关 非小细胞肺癌中EGFR突变率在北美和西欧为10 左右 而在东亚为30 50 其中在亚洲 女性 非吸烟 腺癌患者中EGFR突变率最高 达70 80 10 EGFR突变背景 研究发现EGFR突变与吉非替尼 厄洛替尼的疗效密切有关 其中EGFR突变的患者对吉非替尼 厄洛替尼治疗敏感 有效率在80 以上 而EGFR野生型的患者的有效率在10 以下 吉非替尼 厄洛替尼作为一线药物治疗非小细胞肺癌 相比传统的化疗可以取得更长的无进展生存期 PFS 且副作用相对较小 患者容易耐受 但总体生存期 OS 并未延长 EGFR TKI目前主要用于非小细胞肺癌一线 二线和维持治疗 我国大部分医生将其用于二线 69 4 治疗 41 7 的医生将其用于一线治疗 27 8 的医生将其作为维持治疗药物 11 EGFR突变影响肺癌药物疗效 研究表明EGFR突变型患者使用吉非替尼的疗效要优于卡铂与紫杉醇组合治疗 而在野生型患者中则相反 使用吉非替尼的疗效不如卡铂与紫杉醇组合治疗 MokT S 2009 NEngJMedMaemondoM 2010 NEngJMed 12 EGFR突变检测相关指南 美国国家综合癌症网络 NCCN 2011版的癌症治疗指南中明确指出 EGFR突变 尤其是外显子19的缺失突变和外显子21的L858R突变 与肿瘤对TKIs如吉非替尼治疗敏感性有重要关系 而部分EGFR TKI初始治疗有效的患者后期会发生耐药 与EGFR外显子20突变密切相关 美国临床肿瘤学会 ASCO 在JCO上发表报告 EGFR TKI是携带EGFR突变型的非小细胞肺癌病人的一线治疗药物 有益于进展期非小细胞肺癌患者的个体化治疗 欧洲EMEA指出 易瑞沙 吉非替尼 仅对携带EGFR突变型的非小细胞肺癌患者有效 平均无进展生存期延长3 5月 美国FDA 2013 批准对拟采用阿法替尼 厄洛替尼等EGFR TKI治疗的患者进行EGFR突变检测的试剂盒 therascreenEGFRRGQPCRKit和cobas EGFRMutationTest 我国 非小细胞肺癌临床实践指南 中也明确指出EGFR突变 尤其是19号外显子缺失突变与肿瘤对酪氨酸激酶抑制剂 TKIs 的敏感度有重要关系 对腺癌 大细胞癌 非小细胞肺癌等肺癌组织学类型 EGFR检测为一类推荐 13 EGFR突变位点 常规检测29个 14 EGFR突变与EGFR TKI药物疗效关系 15 ADxEGFR试剂盒突变结果检测 16 ARMS PCR的基本原理和技术特点 17 ARMS PCR原理 ARMS是AmplificationRefractoryMutationSystem 扩增阻碍突变系统 的缩写 根据PCR过程中要求引物和模板间的严格互补配对来实现对突变位点的检测 当引物3 末端出现错配时 产物将不能延伸 因此设计两条上游 或下游 引物 使其3 末端分别与突变位点碱基匹配和错配 共用下游 或上游 引物 分别扩增野生型和突变型目的片断 18 ARMS PCR原理 TwoAllele Specific AS primers oneforeachalleleofaSNParedesigned TheASprimerscontainoneoftwopolymorphicnucleotidesattheprimer3 end Twosetsofprimers eitherforwardorreverseprimerscanbedesigned IfacommonreverseorforwardprimerisusedinaPCRreaction thereactioniscalledallele specificPCR AS PCR YouF M 2008 BMCBioinformatics 19 PCR产物检测 RealtimePCR 每个PCR循环检测荧光信号 不同PCR产物 不同荧光信号相比凝胶电泳 更快 可定量 无PCR产物污染信号产生方法 Scorpion Qiagen 双环探针 厦门艾德 Taqman Molecularbeacons Sybrgreen Yo pro Figure2ThesensitivityofQuanTAS PCRforquantifyingJAK2mutantalleles ZapparoliG V 2013 BMCCancer 20 应用于Realtime PCR的ARMS PCR 21 ARMS技术特点 优点 灵敏度高 0 1 1 操作简便周期短不产生PCR产物污染适用样本类型多 如FFPE 精确突变类型 缺点 方法建立需时较长仅能检测已知突变 22 测序法与ARMS法相比较 23 操作流程及数据解读 24 检测流程与质量控制 标本准备 DNA抽提 突变检测 分析报告 标本种类标本量 SOPOD260 280 新鲜组织 qPCR FFPE SOP阳性及阴性对照问题及解决 SOP报告标准判读形式及检查 25 使用ARMS的KRAS突变检测试剂盒 26 使用ARMS的EGFR突变检测试剂盒 27 等位特异性引物设计 28 KRAS基因序列和常见突变 KRAS序列 atgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatagaggattcctacaggaagcaagtagtaattgatggagaaacctgtctcttggatattctcgacacagcaggtcaagag常见突变 29 三引物设计原理 YouF M 2008 BMCBioinformatics 30 三引物设计 Atgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatagaggattcctacaggaagcaagtagtaattgatggagaaacctgtctcttggatattctcgacacagcaggtcaagag野生型引物 F 5 CTTGTGGTAGTTGGAGCTG 3 19nt 51 突变型引物 F 5 cttgtggtagttggagctA 3 19nt 49 下游引物 R 5 CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC 3 25nt 54 31 三引物设计 下游引物设计 ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG选择序列 5 GACGAATATGATCCAACAATAGAGG 3 互补链 3 CTGCTTATACTAGGTTGTTATCTCC 5 下游引物 5 CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC 3 32 3 端增加错配 如果3 端是弱错配 C A或G T 则需要引入强的错配 A G或C T 才可阻断3 端的扩增 如果3 端是强错配 A G或C T 则需要引入弱的错配 C A或G T 或不需引入错配即可阻断3 端的扩增 当3 端是中度错配 A A C C G G或T T 则需要引入中度的错配 野生型引物 F 5 CTTGTGGTAGTTGGAGCTG 3 突变型引物 F 5 cttgtggtagttggagcCT 3 下游引物 R 5 CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC 3 33 四引物设计 34 四引物设计 Atgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatagaggattcctacaggaagcaagtagtaattgatggagaaacctgtctcttggatattctcgacacagcaggtcaagag内引物 F 5 CTTGTGGTAGTTGGAGCTA 3 内引物 R 5 ACTCTTGCCTACGCCACC 3 外引物 F 5 AtgactgaatataaaCT 3 外引物 R 5 CTCTTGACCTGCTGTGTCG 3 35 KRAS试剂盒开发简介 36 KRAS突变探针和引物设计 KRAS序列 atgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatagaggattcctacaggaagcaagtagtaattgatggagaaacctgtctcttggatattctcgacacagcaggtcaagag1 5 CTTGTGGTAGTTGGAGCTTA 3 12GGT GAT2 5 AAACTTGTGGTAGTTGGAGCGGT 3 12GGT GTT3 5 AACTTGTGGTAGTTGGAGCTGC 3 12GGT GCT4 5 ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTA 3 12GGT AGT5 5 AACTTGTGGTAGTTGGAGCGT 3 12GGT TGT6 5 ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCCC 3 12GGT CGT7 5 GTGGTAGTTGGAGCTGGTAA 3 13GGC GAC8 参照引物 5 CTGAATATAAACTTGTGGTAGTT 3 9 下游引物 5 ACCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC 3 TaqMan探针 5 FAM TCTGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT BHQ1 3 锁核酸阻滞探针 野生型 5 TGGAGCTGGTGGCGT