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miRNA研究策略及技术 2020 4 8 1 RNA干扰 RNA干扰 RNAinterference RNAi 是指一种由双链RNA诱发的基因沉默现象 其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达 microRNAs miRNAs mRNA翻译被抑制shortinterferingRNAs siRNAs 引起mRNA切割 2020 4 8 2 干扰机制 2020 4 8 3 miRNA简介 microRNAs miRNAs 是一种小的内源性非编码RNA分子 大约由21 25个核苷酸组成 通常靶向一个或者多个mRNA 通过翻译水平的抑制调节基因的表达 动物的靶序列在3 非编码区 3 UTR 植物的靶序列在编码区或5 UTR 2020 4 8 4 miRNA生成 miRNA途径开始于一个miRNA基因的pri miRNA primarymiRNA 转录本 这个70 100nt的发卡RNAs pri miRNA 在核内被核糖核酸酶Drosha加工处理而最终成为pre miRNA precursormiRNA pre miRNA被核输出蛋白exportin5转运入胞质 接着被第二个核糖核酸酶Dicer消化为21 25nt的miRNA 这个阶段的miRNA可以结合RISC RNA InducedSilencingComplex 并与靶标mRNA互补图例 2020 4 8 5 miRNA研究流程 2020 4 8 6 miRNA的筛选 深度测序抽提分离小分子 例如18 30nt RNA 通过RT PCR扩增之后 利用solexa深度测序 并进行生物信息学分析 获得miRNA表达谱 深度测序结合生物信息学分析手段 可以对海量数据进行分析 分别统计出已知的miRNA miRNA known 新的miRNA miRNA new 以及可能的新miRNA miRNA cadidatenew 并对新发现的miRNA进行靶基因分析 功能预测等 2020 4 8 7 miRNA芯片利用miRNA芯片 可以高通量分析miRNA表达的时空特异性 不同样本 例如癌组织和癌旁组织 中miRNA的差异表达 寻找在生物学功能上起作用的miRNA 实例 2020 4 8 8 miRNA表达检测 目前检测miRNA的技术主要有以下几种 Northern杂交原位杂交微点阵 microarray 实时定量PCR 2020 4 8 9 Northern杂交 实例 2020 4 8 10 原位杂交 实例 2020 4 8 11 实时定量RTPCR Loop反转录法每次RT只能检测一个miRNA特异性高多个样本中检测同一miRNApolyA加尾法一次RT可检测所有miRNA通用性高适合miRNA高通量检测 2020 4 8 12 2020 4 8 13 2020 4 8 14 引物设计 1 通常情况下 ForwardPrimer序列与待测miRNA序列基本一致 只要将原有的U替换成T即可 例如 2020 4 8 15 2 在特殊情况下 例如当miRNA分子中GC含量偏高时 可在miRNA序列3 端减少3 4个碱基 从而降低引物的Tm值 相反 如果miRNA分子中GC含量偏低时 可在miRNA序列5 端添加几个GC碱基 从而提高引物的Tm值 例如 2020 4 8 16 1OLIGO PrimerAnalysisSoftware 2Primer3 http www genome wi mit edu ftp distribution software 3http www ncbi nlm nih gov BLAST 2020 4 8 17 实例 2020 4 8 18 miRNA功能研究 用特定试剂改变内源miRNAs的水平 观察靶mRNA及编码蛋白的表达 进行信号通路研究功能获得研究 把miRNA导入细胞miRNAmimics 化学方法合成的miRNA模拟物miRNA表达克隆功能缺失研究 抑制miRNA表达miRNAinhibitormiRNA抑制剂表达克隆 2020 4 8 19 过表达miRNA 将miRNAmimics转染到细胞中 能实现miRNA瞬时过表达构建miRNA表达载体可进行长期研究过表达载体中有插入成熟miRNA pre miRNA及pri miRNA序列三种形式载体选择有三种 慢病毒 腺病毒 质粒 2020 4 8 20 抑制miRNA miRNA抑制剂克隆导入细胞后表达的miRNA抑制剂 miArrest 特异地结合它们的靶miRNA 形成稳定的复合物 阻止了miRNA对靶标mRNA的降解或者翻译抑制 上调miRNA靶标基因的表达 2020 4 8 21 化学合成的miRNA抑制剂是序列特定的 单链寡核苷酸分子 适合瞬时转染 2020 4 8 22 miRNA靶基因的寻找 miRNA的靶基因的寻找主要通过利用生物信息学方法和生物学实验方法 生物信息学方法主要是利用某种算法对靶基因样本进行评分及筛选 为了得到更为可靠的靶基因预测 通常综合多个预测方法 取其共同预测的基因作为研究重点 2020 4 8 23 常用miRNA靶标数据库 miRbase microRNA基因注释数据库 目前只提供了microRNA的靶标的预测软件的链接 如 PicTar 网址 http mirbase org index shtmlTarbase 一个收集已被实验验证的microRNA靶标数据库 网址 http microrna gr tarbase targetScan 基于靶mRNA序列的进化保守等特征搜寻动物的microRNA靶基因 是预测microRNA靶标假阳性率较低的软件 网址 http www targetscan org PicTar 基于microRNA或microRNA靶标联合作用等特征开发的搜寻动物的microRNA靶基因的软件 假阳性率也较低 网址 http pictar mdc berlin de 2020 4 8 24 实例 2020 4 8 25 miRNA靶基因的鉴定 利用荧光定量PCR及Westernblot方法分别检测转染或敲除miRNA后细胞中mRNA水平及蛋白水平的变化 从而确定miRNA与靶基因的对应关系 2020 4 8 26 miRNA靶位点的鉴定 荧光素酶报告基因法基本原理是首先构建荧光素酶表达载体 将希望鉴定的miRNA靶基因的3 UTR构建到荧光素酶基因的3 UTR中 然后将荧光素酶基因表达载体 转染细胞并改变细胞中相应miRNA的表达水平 最后检测荧光素酶的表达情况以分析转染3 UTR中是否含有miRNA的靶位点 2020 4 8 27 荧光素酶报告系统 双荧光素酶报告基因测试 结合萤火虫和海肾荧光素酶的共报告基因测试技术 多克隆位点 2020 4 8 28 技术流程 获得miRNA对应DNA模板扩增含有靶位点的3 UTR序列靶序列克隆 构建到荧光素酶表达载体PCR产物双酶切 连入同样双酶切的载体中 连接产物转化DH5 阳性克隆鉴定 荧