广西地方标准《陆川猪及其肉制品的分子定量鉴定方法》（征求意见稿）

ICS67050X04DB45广西壮族自治区地方标准DB45/TXXXXX2017陆川猪及其肉制品的分子定量鉴定方法MOLECULARQUANTITATIVEIDENTIFICATIONMETHODOFLUCHUANPIGANDITSMEATPRODUCTS（征求意见稿）2017XXXX发布2017XXXX实施广西壮族自治区质量技术监督局发布DB45/TXXXXX2017I目次前言II1范围12规范性引用文件13术语和定义14原理25仪器与试剂26鉴定步骤27结果判定与表述38实验室防污染措施4附录A（资料性附录）陆川猪特异性条带的核苷酸序列信息5附录B（规范性附录）PCR所用引物信息6附录C（资料性附录）样品DNA提取方法7DB45/TXXXXX2017II前言本标准按照GB/T112009给出的规则起草。本标准由广西大学提出。本标准起草单位广西大学、广西陆川县质量技术监督局、广西分析测试研究中心、广西经贸职业技术学院。本标准主要起草人黄丽、黄磊、杨磊、黄岛平、庞理松、夏宁、林葵、韦保耀、滕建文、庞丽。DB45/TXXXXX20171陆川猪及其肉制品的分子定量鉴定方法1范围本标准规定了陆川猪及其肉制品的分子定量鉴定的术语和定义、原理、仪器与试剂、鉴定步骤、结果判定与表述和实验室防污染措施的要求。本标准适用于广西壮族自治区境内陆川猪及其肉制品的分子定量鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义以下术语和定义适用于本文件。31陆川猪LUCHUANPIG因原产与广西东南部的陆川县而得名，现主要分布于玉林、钦州、梧州等地，体型特点为体躯矮，短，肥，宽。头较短小，耳小而薄向外平伸，额有横行皱纹。32实时荧光QPCRREALTIMEQUANTITATIVEPCRDDETECTING聚合酶链反应（聚合酶链反应）是一种在体外快速扩增特定基因或DNA片段的方法。由“热变性复性延伸”三步反应组成一个PCR循环，经过多次循环反应，使目标DNA得以大量扩增。33CT值THRESHOLDVALUE指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，每个模板的CT值与该模板的起始目地基因数量的对数存在线性关系，即起始目地基因数量越多，CT值越小。34特异性引物SPECIFICPRIMER针对特定模板DNA片段设计的两段与模板两端分别互补的一对寡核苷酸序列，在PCR反应中与模板DNA两端分别特异性结合。DB45/TXXXXX201724原理提取样品中基因组DNA，利用陆川猪特异性引物B和SYBR染料进行实时荧光QPCR扩增检测，同时设置阴性对照及空白对照。根据扩增的CT值，判定样品中是否含有陆川猪的特异性基因。陆川猪特异性片段序列信息见附录A。5仪器与试剂51主要仪器511实时荧光QPCR仪。512高速冷冻离心机。513冷藏冷冻冰箱。514漩涡振荡器。515微量移液器（1L、10L、100L、1000L）。51602ML光化学QPCR管。52主要试剂521除另有规定外，所有试剂均为分析纯或者生化试剂。522实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。523DNA提取试剂盒（GENOMICDNAISOLATIONKITINSTRUCTIONMANUAL）。5242XSYBRQPCRMASTERMIX。525一次性PE手套。52615ML离心管。53特异性引物根据陆川猪线粒体细胞色素B基因的核苷酸序列设计引物B，引物序列见附录B，使用前先对其进行预处理，使用小型离心机对引物进行2S左右离心，后加入说明书上各引物的稀释所需体积的TE溶液，使引物浓度达到100M，完成后将引物放入20冰箱中保存备用。6鉴定步骤61样品DNA提取依照通用型基因组DNA提取试剂盒（GENOMICDNAISOLATIONKITINSTRUCTIONMANUAL）中动物组织基因组DNA提取操作进行提取，方法参见附录C。62DNA纯度的测定取5LDNA溶液加灭菌水稀释至1ML，用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260NM和280NM处的吸光值A260和A280。DNA的浓度按照式（1）计算1105NAC式中CDNA浓度，单位为微克每微升（G/L）；DB45/TXXXXX20173A260NM处的吸光值；N核酸稀释倍数。注当A260/A280比值在1720之间时，适宜于PCR扩增。63实时荧光QPCR反应体系符合表1的要求。配置时在每个QPCR管内按照表1从上至下的顺序依次加入试剂和模板，注意在加样时应使样品DNA模板溶液完全落入反应液中，不应粘附于管壁上，如若管壁上存在粘附残留，必须先进行离心使其全部落入管底，再将PCR管放入QPCR仪内准备扩增。表1QPCR反应体系试剂名称剂量引物（上游）04L引物（下游）04LDNABUFFER20L2SYBRQPCRMASTERMIX100LDNA模板10L补DDH2O至200L64实时荧光QPCR反应程序设定好QPCR仪的扩增程序后，检查QPCR反应管是否摆放正确，开始运行仪器进行QPCR反应。QPCR反应结束后，可在程序QPCR仪的“数据获取”界面获得被测样品的CT值。65实验对照651鉴定过程设阴性对照、空白对照。652阴性对照将地方土猪或地方黑猪或白条猪或其他非陆川猪按61提取DNA，按63配置QPCR反应体系，按64程序进行QPCR扩增；653空白对照以灭菌水代替DNA模板，按63配置PCR反应体系，按64程序进行QPCR扩增。66实时荧光QPCR反应运行设定好QPCR仪的扩增程序后，检查QPCR反应管是否摆放正确，盖紧反应管的盖子，开始运行仪器进行QPCR反应。QPCR反应结束后，可在程序QPCR仪的“数据获取”界面获得被测样品的CT值。7结果判定与表述71质量控制以下条件有一条不满足时，结果视为无效A空白对照目标基因检测无荧光增幅现象。B阴性对照目标基因检测无荧光增幅现象。72结果判定按照以下方法进行判定如CT值200，则判定为被检样品阳性；DB45/TXXXXX20174如CT值300，则判定为被检样品阴性；如200CT值300，则重复试验一次。如再次扩增后CT值为200CT值250，则判定被检样品含二元猪源性成分者。如再次扩增后CT值为250CT值300，则判定被检样品含三元猪源性成分者。73结果表述应按照以下要求表述结果为阳性者，表述为“被检样品为纯种陆川猪”；结果为阴性者，表述为“被检样品为非陆川猪”；结果为含二元猪源性成分者，表述为“被检样品为二元陆川猪”；结果为含三元猪源性成分者，表述为“被检样品为三元陆川猪”。8实验室防污染措施按照GB/T27403的规定执行。DB45/TXXXXX20175AA附录A（资料性附录）陆川猪特异性条带的核苷酸序列信息附录A给出了陆川猪特异性条带的核苷酸序列信息。CAACCAAAACAAGCATTCCATTCGTATGCAAACCAAAACGCCAAGTACTTAATTACTATCTTTAAAACAAAAAAACCCATAAAAATTGCGCACAAACATACAAATATGCGACCCCAAAAATTTAACCATTAAAAACAAAAAATTTAATATATTATAGCCCTATGTACGTCGTGCATTAACTGCTAGTCCCCATGCATATAAGCATGTACATATTATTATTAATATTACATAGTACATATTATTATTGATCGTACATAGCACATATCATGTCAAATAACTCCAGTCAACATGCGTATCACCACCATTAGATCACGAGCTTAATTACCATGCCGCGTGAAACCAGCAACCCGCTTGGCAGGGATCCCTCTTCTCGCTCCGGGCCCATAAATCGTGGGGGTTTCTATTGATGAACTTTAACAGGCATCTGGTTCTTACTTCAGGGCCATCTCATCTAAAATCGCCCACTCTTTCCCCTTAAATAAGACATCTCDB45/TXXXXX20176BB附录B（规范性附录）PCR所用引物信息表B1给出了PCR所用引物信息。表B1PCR所用引物信息检测基因引物序列5CACTTACCGGAGCCCTATCA3陆川猪线粒体细胞色素B5GGTGGTCAGCAACCTCCTAA3DB45/TXXXXX20177CC附录C（资料性附录）样品DNA提取方法C1方法说明依照通用型基因组DNA提取试剂盒（GENOMICDNAISOLATIONKITINSTRUCTIONMANUAL）中动物组织基因组DNA提取说明进行操作。C2操作方法C21将待测的原料猪肉，去除肥肉后，用灭菌刀切分。提取时切取05G肉样，剪碎后用干净镊子或药匙转移至干净的离心管中；C22向离心管中加入400LBUFFERL1和20LFOREGENEPROTEASE，涡旋混匀，放置于65金属浴或水浴中25MIN30MIN，其间每间隔10MIN涡旋混匀一次，促进酶解；C23酶解完成后，加入400LBUFFERL2，颠倒混匀至分层消失，置于65金属浴或水浴中10MIN，然后12000RPM室温离心5MIN10MIN，收集上清液；C24将上清液用移液器转移到离心柱中，再将离心柱放入收集管中，然后12000RPM室温离心1MIN，弃掉收集管中的废液；C25向离心柱中加入500LBUFFERPW，12000RPM室温离心1MIN，弃掉收集管中的废液；C26再向离心柱中加入700LBUFFERWB，12000RPM离心1MIN，弃掉收集管