高效液相色谱法

第八章 高效液相色谱法由于大量有机物、离子型化合物易受热分解或失活物质不能用GC分析，因此需要发展HPHC。一、高效液相色谱仪（HPHC）的组成1.送液部分1.1溶剂槽，一般采用耐腐蚀的玻璃瓶或聚四氟乙烯瓶。1.2送液泵应具备以下特点： 耐高压 脉动小，送液量稳定，流量范围广(010mL/min) 操作简单，维修方便当我们需要混合三种流动相时，可利用电磁阀的功能将吸液分划成ABC三部分，分划比在定组分送液时是一定的。在梯度送液时，分划比则按所设定的程度时时刻刻都在变化。前者相当于GC中恒温分析，后者犹如GC中程序升温。LC比GC贵是因为用了高压泵。2.进样阀部分 2.1隔膜式 有硅橡胶隔膜，用微量注射器进样优点：简单便宜，死体积小缺点：高压进样时漏液会产生误差 2.2进样阀方式在高压穴通阀上装有一根一定容量的管子(即定量管)，首先在红线的流路上用注射器将样品注入定量管中(一般1mL)。然后将阀转换为黑线环路，此时流路将定量管样品送入柱子中。优点：重现性好缺点：不能注入小体积样品（1.2L）改变注入量时要更换定量管。.分离部分3.1色谱柱一般将填料装入色谱柱(材料多用不锈钢)中。色谱柱长度和内径也不相同3.2柱温柱温影响分离效率、样品亲和力、扩散速度。此外也影响样品的溶解度和溶剂的粘度。.检测器分离后的成分用检测器测定其浓度，然后定性定量分析。4.1紫外检测器(UVD)SPD6A以低压汞灯的最强发射线(253.8nm)为测定波长 因为波长是固定的，所以不能作波长扫描 例如：UVD2型就是这种高灵敏度检测器。采用了双光束光学系统满刻度时最大漂移不超过0.001吸光值线性范围可达2.00吸光值4.2荧光检测器用途：用于检测物质本身具有荧光或将无荧光物质衍生成荧光体4.3示差折光仪测定折射率有以下两种方法UV、示差、荧光检测器的比较UV示差折光RT（折光率）荧光性能选择通用选择是否可梯度洗脱可不可可线性范围上限2.5610-31.5线性范围510411041104满刻度灵敏度(噪音1%)0.00511050.005灵敏度(对合适样品)51011 g/mL5107 g/mL1091010 g/mL流速改变的影响无无无温度变动的影响很小1104/很小应用有双键芳香类有机物医药生化对检测器要求高灵敏度低噪声大的线性范围对所有化合物都响应用得最多的是UV 对于有双键的芳香族化合物,有UV吸收就用UV检测器因为UV对甲醇，水无吸收，所以甲醇，水可用作流动相噪声 一般由于电引起漂移灵敏度 因为声音大小与样品量有关打入一个样品，就发出声号二倍于噪声时，这时的样品量叫灵敏度4.4光电二极管阵列吸光度检测器是同时可以得到吸光度、波长、时间这样三维情报的检测器能以实际的时间瞬时测定在所有波长上的吸光度，可得到立体的色谱图(见图).梯度洗脱装置梯度洗脱类似GC中程序升温 tRtM流动相A、洗脱时，若样品中各成分容量因子相差大，则 大的峰宽而低且分析时间长 tM流动相B、是溶解力强。洗脱时，各成分很快出来，则K(1.2)小的峰达不到分离AB 若将A、B流动相的组成随时间改变，则即分离好，又缩短分析时间二、HPLC分离方式、 吸附色谱、 分配色谱、 离子交换色谱、 凝胶色谱.吸附色谱历史最早充填剂多用硅胶 根据填充剂吸附活性点对样品的吸收系数不同而分离2.分配色谱从前在载体上涂液体或聚合物现在固定相大多是在载体上键合一些稳定的物质或采用多孔合成聚合物作充填剂根据固定相与流动相的极性不同而分为 正相分配色谱和反相分配色谱固定相流动相正相分配极性非极性反相分配非极性极性.离子交换色谱离子交换色谱是根据固定相的离子交换基和样品成分中的离子性基进行交换来分离的。.凝胶色谱凝胶色谱分离方法与上述三种方法大不相同它是利用分子振动效应，根据样品分子的大小而进行分离。所以又称为排斥色谱充填剂多采用：一定孔径的多孔性聚合物样品中小分子进入细孔中，洗脱时间长；大分子进不到细孔中，很快被洗脱出来。三、HPLC使用的填充剂填充剂和流动相的选择：GC 择担体和固定液为主(即选择充填剂为主的固定相HPLC 除固定相选择外，对流动相选择也很重要下面对各种分离方式中，分离域份和、常用流动相进行叙述用于流动相吸附色谱溶于有机溶剂的非离子型化合物正己烷氯仿二氯甲烷分配色谱正相固定相极性溶于有机溶剂的常有极性基团的同上反相固定相非性常用方法分析样品范围广保留值大的是非极性样品水甲醇水乙腈离子交换色谱分析水溶性离心型化合物流动相中盐的浓度及种类PH值影响大常用盐有：磷酸盐、醋酸盐、硼酸盐凝胶色谱分子量2000化合物四氢呋喃三氯甲烷根据分离方程：变分离度，即改变k、N、，需改变固定相、流动相及温度，找出最佳分离条件四、LC在环保方面的应用一、农药残留量分析 1.含氯农药 多氯联苯：液固；V；标法；动相：正己烷；固定相：硅胶柱 2.有机磷农药 3.除虫菊 ODS（C18柱）,甲醇/水二、致癌物质1.霉素2. 亚硝胺(香烟中的亚硝胺) C18柱 乙腈/水 作动相，可分离亚硝胺的顺式及反式异构体3.苯并芘：ODS 柱甲醇/水，UV，梯度淋洗三、水质分析样品的富集很重要：把大量的水通过浓缩柱(C18柱)再用各种不同的极性溶(正己烷，三氯甲烷，等)淋洗，得到芳烃，非芳烃再分析。四、空气的分析五、LC在生化方面的应用一、蛋白质分析 若用正相柱，反相柱时，若样品中含蛋白质，则柱子很快就要坏分析药物的代谢，有效期间，可决定n小时服一次。分析药物的成分，吸收多少去蛋白质(高分子量)方法很多，去掉后用正相或反相柱不去蛋白质时必须用凝胶柱交换葡萄糖也用凝胶柱二、肽类的分析 一般用LC分析小肽，用C18柱，流动相 甲醇/水，梯度淋洗三、核酸 因为是离子性化合物，可用离子交换柱，用薄膜型四、氨基酸 一般用柱后衍生化法，用荧光检测器六、LC在药物方面的应用1、药物的预处理因为药物有片剂，油膏，水剂等主要测定：纯度，中间体的分析，药物的代谢首先要预处理水剂：用离子交换柱，稀释或浓缩片剂：研成粉末后再用有机溶