云南省甘蔗白叶病病原巢式PCR检测技术规程2018征求意见稿.doc

云南省甘蔗白叶病病原巢式PCR检测技术规程2018征求意见稿 ICS65.020B15中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局备案号DB53/T XXXXX2018甘蔗白叶病病原巢式PCR检测技术规程2018-XX-XX发布2018-XX-XX实施云南省质量技术监督局发布DB53/T XXXXX2018I前言本标准按照GB/T1.1xx标准化工作导则第1部分标准的结构和编写给出的规则起草。 本标准由云南省农业科学院提出。 本标准由云南省农业标准化技术委员会(YNTC07)归口。 本标准起草单位云南省农业科学院甘蔗研究所。 本标准主要起草人仓晓燕、黄应昆、李文凤、王晓燕、张荣跃、单红丽、罗志明、尹炯。 DB53/T XXXXX20181甘蔗白叶病病原巢式PCR检测技术规程1范围本标准规定了仪器与器材、试剂、采样及样品处理、DNA提取、巢式PCR检测、及结果判定等。 本标准适用于甘蔗白叶病病原巢式PCR检测。 2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T28067甘蔗黄叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法。 3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。 3.1巢式PCR巢式PCR是一种使用两对PCR引物扩增完整的片段，第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似，第二对引物结合在第一次PCR产物内部，使得二次PCR扩增灵敏度高于一次PCR扩增的变异聚合酶链反应。 4缩略语下列缩略语适用于本文件。 bp碱基对(base pair)CTAB十六烷基三甲基溴化铵(Hexadecyl TrimethylAmmonium Bromide)dNTPs脱氧核苷三磷酸混合液(Deoxyribonucleoside Triphosphatesmixture)ddH2O双蒸水EDTA乙二胺四乙酸(Edetate Disodium)PCR聚合酶链式反应(Polymerase chainreaction)Tris三羟甲基氨基甲烷(Hydroxymethyl MethylAminomethane)5仪器与器材、试剂5.1仪器与器材DB53/T XXXXX20182仪器与器材包括台式离心机、小型离心机、微量可调移液器、恒温水浴锅、旋涡混匀仪、核酸蛋白分析仪、PCR扩增仪、电泳槽、电泳仪等电泳装置、凝胶成像仪、冰箱（温控范围4和-20）、高压灭菌锅、鼓风干燥箱、液氮罐、电子天平、带滤芯移液头、PCR反应管等。 5.2试剂除另有规定外，所用试剂均为分析纯。 5.2.1DNA提取试剂DNA提取试剂及配制方法见附录A。 5.2.2PCR试剂PCR试剂及配制方法参见附录A。 5.2.3电泳缓冲液储存液为50倍TAE电泳缓冲液，配制方法见附录A，工作液用ddH2O将储存液稀释50倍后获得。 5.2.4扩增产物检测试剂琼脂糖、Goldenview核酸染料、6倍上样缓冲液、DNA分子量标准。 6采样及样品处理6.1采样工具采样工具处理按照GB/T28067的要求执行。 6.2采样方法采样方法参照GB/T28067的要求执行。 其中，叶片样品采集时首选疑似甘蔗白叶病病株，具体参见附录B，样品独立分装，编号备用。 6.3样品保存样品存放与运送按照GB/T28067要求执行。 7DNA提取DNA提取方法参见附录A8巢式PCR检测巢式PCR检测方法参见附录C。 9结果判定DB53/T XXXXX20183阳性对照有条带，阴性对照和空白对照无条带时，检测结果有效，当检测结果有效时，依据表1进行结果判定。 表1判定表目的条带大小（bp）样品阳性对照阴性对照空白对照结果判定1240有有无无含白叶病植原体1240无有无无不含白叶病植原体DB53/T XXXXX20184A A附录A（规范性性附录）DNA提取A.1DNA提取试剂配制DNA提取试剂配制方法见表A.1。 表A.12倍CTAB抽提缓冲液组分配制量（L）配制方法1.0molL-1Tris-HCl(pH8.0)母液1称取121.0g Tris，溶解于800mL的ddH2O中，用6molL-1的HCL调节pH至8.0后，用ddH2O定容到1.0L。 0.5molL-1EDTA(pH8.0)的母液1称取186.0g Na2EDTA2H2O，加入800mLddH2O，充分搅拌，用2molL-1的NaOH调节pH至8.0后，用ddH2O定容到1.0L。 2倍CTAB抽提缓冲液1依次加入20g的CTAB粉末，100mL的1.0molL-1的Tris-HCl(pH8.0)母液，40mL的0.5molL-1的EDTA(pH8.0)的母液，81.8g的NaCl，用灭菌双蒸定容到1.0L。 A.2DNA提取DNA提取方法如下a)取数支1.5mL无DNA酶的Eppendorf管，1管阳性对照、1管阴性对照，对每个管进行编号。 b)称取0.2g新鲜叶片样品剪细，加液氮充分研磨成粉末状后，转入2.0mL灭菌离心管。 c)立即加入1.0mL预热（约65C）的2倍CTAB抽提缓冲液，震荡混匀，65C水浴30min，室温12,000rpm离心10min。 d)取上清加等体积的氯仿/异戊醇(V/V=24:1)，剧烈振荡混匀，室温12,000rpm离心10min。 e)取750?L上清至另一新的灭菌离心管中，加2/3体积异丙醇，颠倒混匀，-20C放置1h，12000rpm离心10min。 f)沉淀加入70%乙醇500L，12000rpm离心5min，弃上清，沉淀于中室温下1.5mL灭菌离管风干，溶于50?LddH2O。 g)用核酸蛋白分析仪测定波长260nm和280nm处吸光值，当A260/A280比值在1.82.0之间时，将样于-20C保存备用。 DB53/T XXXXX20185B B附录B（资料性附录）甘蔗白叶病植原体基本信息B.1甘蔗白叶病病原甘蔗白叶病是一种由甘蔗白叶植原体(Surgarcane whiteleaf phytoplasma)引起，并随带病种苗远距离传播的危险性检疫病害。 B.2发病症状发病植株均表现为叶质柔软、白化，分蘖明显增多。 有的整叶白化，有的呈条纹状白化，有的呈斑驳状白化。 部分病株分蘖明显增多，植株矮缩，茎叶细小，见图B.1。 图B.1甘蔗百叶病症状图A病株；图B病丛；图C病田DB53/T XXXXX20186C C附录C（规范性附录）巢式PCR检测操作方法C.1扩增试剂配制C.1.1巢式第一次PCR反应混合液巢式第一次PCR反应混合液配制见表C.1。 表C.1巢式PCR反应混合液(25L体系)组分使用量（L）终浓度DNA1.0-20molL-1上游引物P11.00.4molL-120molL-1下游引物P71.00.4molL-110倍PCR缓冲液2.51倍25mmolL-1MgCl22.00.8molL-110mmolL-1dNTPs2.00.8molL-15UL-1Taq酶0.20.32UL-1ddH2O15.3-C.1.2巢式第二次PCR反应混合液巢式第二次PCR反应混合液配制见表C.2。 表C.2巢式PCR反应混合液(25L体系)组分使用量（L）终浓度DNA1.0-20molL-1上游引物R16F2n1.00.4molL-120molL-1下游引物R16R21.00.4molL-110倍PCR缓冲液2.51倍25mmolL-1MgCl22.00.8molL-110mmolL-1dNTPs2.00.8molL-15UL-1Taq酶0.20.32UL-1ddH2O15.3-C.2对照阳性对照确认含甘蔗白叶病植原体样品的DNA做阳性对照。 阴性对照确认不含甘蔗白叶病植原体样品的DNA做阴性对照。 空白对照用等体积ddH2O替代样品做空白对照。 DB53/T XXXXX20187C.3引物C.3.1引物序列巢式第一次PCR上游引物P15-AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATT-3，下游引物P75-CGTCCTTCATCGGCTCCT-3。 巢式第二次PCR上游引物R16F2n5-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3，下游引物R16R25-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3。 C.3.2引物的配制上述巢式PCR引物用ddH2O稀释至浓度为20molL-1。 C.4巢式PCR扩增C.4.1巢式PCR体系配制巢式PCR体系配制方法如下a)在冰上融化各反应试剂组分，瞬间低速离心（2,000rpm下离心3s5s），加入阳性对照、阴性对照和空白对照。 根据测试样品数量，计算各试剂使用量，每份样品设置2个平行反应。 h)第一次PCR反应25L PCR反应体系，按表C.1依次加入反应试剂，瞬间低速离心混匀。 i)第二次PCR反应取第一次PCR扩增产物稀释30倍，取1.0L作扩增模板，按表C.2依次加入反应试剂，瞬间低速离心混匀。 C.4.2巢式PCR扩增程序在Bio-Rad C1000PCR扩增仪上进行扩增，巢式PCR扩增程序如下a)第一次PCR反应程序94C预变性3min；94C变性30s，55C退火60s，72C延伸1min，35个循环；72C延伸10min。 b)第二次反应程序94C预变性3min；94C变性30s，57C退火30s，72C延伸1min，35个循环；72C延伸10min。 C.5琼脂糖电泳检测与凝胶成像分析琼脂糖电泳检测与凝胶成像分析方法如下:a)配制浓度为1.5%（W/V）的琼脂糖凝胶（即1倍TAE电泳缓冲液100mL加1.5g琼脂糖），加热融化混匀，冷却至60C左右，加入浓度为0.005%Goldenview核酸染料（按每100mL琼脂糖溶液中加入5?L核酸染料溶液的比例），混匀后倒入胶槽，插上样品梳。 b)室温下待凝